Protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina
Summary
El intestino es vital para la digestión y la absorción. Cada región (duodeno, yeyuno, íleon, colon) cumple funciones distintas debido a estructuras celulares únicas. El estudio de la fisiología intestinal exige un análisis meticuloso de los tejidos. Este protocolo describe la fijación y el procesamiento de tejidos mediante la técnica de rollo suizo, lo que garantiza una inmunotinción precisa a través de la preservación y orientación adecuadas de los tejidos.
Abstract
El intestino es un órgano complejo compuesto por el intestino delgado y el intestino grueso. El intestino delgado se puede dividir a su vez en duodeno, yeyuno e íleon. Cada región anatómica del intestino tiene una función única que se refleja en las diferencias en la estructura celular. La investigación de los cambios en el intestino requiere un análisis en profundidad de las diferentes regiones de los tejidos y las alteraciones celulares. Para estudiar el intestino y visualizar grandes trozos de tejido, los investigadores suelen utilizar una técnica conocida como rollos suizos intestinales. En esta técnica, el intestino se divide en cada región anatómica y se fija en una orientación plana. Luego, el tejido se enrolla cuidadosamente y se procesa para su inclusión en parafina. La fijación y orientación adecuadas del tejido es una técnica de laboratorio que a menudo se pasa por alto, pero es de vital importancia para el análisis posterior. Además, el laminado inadecuado del tejido intestinal puede dañar el frágil epitelio intestinal, lo que conduce a una mala calidad del tejido para la inmunotinción. Asegurar un tejido bien fijado y orientado correctamente con estructuras celulares intactas es un paso crucial que garantiza una visualización óptima de las células intestinales. Presentamos un método rentable y sencillo para hacer panecillos suizos para incluir todas las secciones del intestino en un solo bloque incrustado en parafina. También describimos la tinción optimizada con inmunofluorescencia del tejido intestinal para estudiar diversos aspectos del epitelio intestinal. El siguiente protocolo proporciona a los investigadores una guía completa para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la técnica de rollo suizo y la inmunotinción. El empleo de estos enfoques refinados preserva la intrincada morfología del epitelio intestinal y fomenta una comprensión más profunda de la fisiología y la patobiología intestinales.
Introduction
La arquitectura celular del intestino plantea un desafío único para mantener su integridad estructural cuando el tejido intestinal se preserva para la inmunotinción. El intestino delgado está formado por estructuras alargadas en forma de dedos conocidas como vellosidades1. Estas vellosidades a menudo se deforman durante los procesos de incrustación. Asegurarse de que los investigadores dispongan de técnicas para incrustar correctamente los intestinos con el fin de lograr secciones transversales, lo que permite la visualización de todas las regiones del intestino, así como de las capas que componen el intestino (es decir, la muscular propia, la mucosa y la serosa), es crucial para un análisis experimental sólido2. La fijación inadecuada, la fijación excesiva y el manejo inadecuado de los tejidos comprometerán la integridad del tejido, lo que provocará daños inadvertidos en el epitelio intestinal 3,4. El daño del epitelio intestinal durante estos pasos puede disminuir significativamente la calidad de los análisis posteriores, como la inmunofluorescencia, independientemente de la eficacia de los protocolos de inmunohistoquímica y de los anticuerpos empleados.
La inmunotinción, al igual que la fijación adecuada de los tejidos, es una parte importante de la investigación biomédica. Cuando se hace bien, la inmunotinción puede iluminar aspectos previamente desconocidos de la estructura y función celular. La tinción con inmunofluorescencia de secciones de parafina puede ser un desafío debido a las modificaciones fisicoquímicas resultantes del proceso de fijación e inclusión de parafina5. La fijación y la inclusión de parafina dan como resultado un enmascaramiento de antígenos que puede interferir con la inmunofluorescencia, la detección de epítopos de interés6. La fijación tardía puede inducir la degradación proteolítica, lo que resulta en una tinción debilitada o ausente de los epítopos críticos7. Además, los anticuerpos suelen ser imprecisos con altos niveles de antecedentes. Los protocolos de inmunotinción que promueven la unión consistente y específica de anticuerpos y una alta relación señal-ruido pueden proporcionar información valiosa para los investigadores.
Aquí, proporcionamos un protocolo integral diseñado para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la preparación de Swiss roll8 y la inmunotinción. Haciendo hincapié en las directrices para preservar la integridad del intestino, el protocolo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una metodología sólida para mejorar la calidad y la fiabilidad de los estudios de imágenes de inmunofluorescencia. También hemos buscado utilizar recursos rentables, incluido el papel de filtro y la recuperación casera de antígenos, soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos para hacer que el protocolo sea más accesible para los laboratorios que pueden tener fondos restringidos. Al igual que con todos los protocolos experimentales, los investigadores deben optimizar el protocolo actual en función de su enfoque experimental y las áreas de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un método optimizado para la fijación de tejidos utilizando la técnica del rollo suizo para preservar la arquitectura intestinal y promover una inmunotinción precisa. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para investigar una amplia variedad de cuestiones de investigación relacionadas con la fisiología intestinal y la biología celular19. Se han publicado varios métodos de laminación suizos optimizados que son muy útiles20,21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por las subvenciones K01 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) DK121869 a ACE y esta publicación fue apoyada en parte por T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) y las subvenciones fundamentales de HCS a SAD & RS. Este trabajo contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) para ACE y contó con el apoyo del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas de MUSC (P30 DK123704) y el COBRE en Enfermedades Digestivas y Hepáticas (P20 GM120475). Las imágenes se realizaron utilizando el núcleo de imágenes celulares y moleculares del MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
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