Protocollo ottimizzato per Swiss Rolls intestinali e colorazione in immunofluorescenza di tessuto incluso in paraffina

Summary

L’intestino è vitale per la digestione e l’assorbimento. Ogni regione – duodeno, digiuno, ileo, colon – svolge funzioni distinte a causa di strutture cellulari uniche. Lo studio della fisiologia intestinale richiede un’analisi meticolosa dei tessuti. Questo protocollo delinea la fissazione e la lavorazione dei tessuti utilizzando la tecnica del rullo svizzero, garantendo un’immunocolorazione accurata attraverso un’adeguata conservazione e orientamento dei tessuti.

Abstract

L’intestino è un organo complesso composto dall’intestino tenue e dall’intestino crasso. L’intestino tenue può essere ulteriormente suddiviso in duodeno, digiuno e ileo. Ogni regione anatomica dell’intestino ha una funzione unica che si riflette nelle differenze nella struttura cellulare. Indagare sui cambiamenti nell’intestino richiede un’analisi approfondita delle diverse regioni dei tessuti e delle alterazioni cellulari. Per studiare l’intestino e visualizzare grandi pezzi di tessuto, i ricercatori usano comunemente una tecnica nota come involtini svizzeri intestinali. In questa tecnica, l’intestino è diviso in ciascuna regione anatomica e fissato in un orientamento piatto. Quindi, il tessuto viene accuratamente arrotolato e lavorato per l’inclusione della paraffina. La corretta fissazione e orientamento dei tessuti è una tecnica di laboratorio spesso trascurata, ma è di fondamentale importanza per l’analisi a valle. Inoltre, un rotolamento svizzero improprio del tessuto intestinale può danneggiare il fragile epitelio intestinale, portando a una scarsa qualità dei tessuti per l’immunocolorazione. Garantire un tessuto ben fissato e correttamente orientato con strutture cellulari intatte è un passo cruciale che garantisce una visualizzazione ottimale delle cellule intestinali. Presentiamo un metodo semplice ed economico per la produzione di involtini svizzeri che include tutte le sezioni dell’intestino in un unico blocco incorporato in paraffina. Descriviamo anche la colorazione ottimizzata in immunofluorescenza del tessuto intestinale per studiare vari aspetti dell’epitelio intestinale. Il seguente protocollo fornisce ai ricercatori una guida completa per ottenere immagini di immunofluorescenza di alta qualità attraverso la fissazione del tessuto intestinale, la tecnica Swiss-roll e l’immunocolorazione. L’impiego di questi approcci raffinati preserva l’intricata morfologia dell’epitelio intestinale e favorisce una comprensione più profonda della fisiologia intestinale e della patobiologia.

Introduction

L’architettura cellulare dell’intestino rappresenta una sfida unica nel mantenere la sua integrità strutturale quando il tessuto intestinale viene preservato per l’immunocolorazione. L’intestino tenue è costituito da strutture allungate simili a dita note come villi¹. Questi villi spesso diventano malformati durante i processi di inclusione. Garantire che i ricercatori dispongano di tecniche per incorporare correttamente gli intestini per ottenere sezioni trasversali, consentendo la visualizzazione di tutte le regioni dell’intestino, nonché degli strati che compongono l’intestino (ad esempio, la muscularis propria, la mucosa e la sierosa), è fondamentale per una solida analisi sperimentale². Una fissazione inadeguata, una fissazione eccessiva e una manipolazione impropria dei tessuti compromettono l’integrità dei tessuti, con conseguente danno involontario all’epitelio intestinale ^3,4. Danneggiare l’epitelio intestinale durante queste fasi può ridurre significativamente la qualità delle analisi successive, come l’immunofluorescenza, indipendentemente dall’efficacia dei protocolli di immunoistochimica e degli anticorpi impiegati.

L’immunocolorazione, come una corretta fissazione dei tessuti, è una parte importante della ricerca biomedica. Se fatta bene, l’immunocolorazione può illuminare aspetti precedentemente sconosciuti della struttura e della funzione cellulare. La colorazione in immunofluorescenza delle sezioni di paraffina può essere difficile a causa delle modifiche fisico-chimiche derivanti dal processo di fissazione e inclusione della paraffina⁵. La fissazione e l’inclusione della paraffina provocano il mascheramento dell’antigene che può interferire con la rilevazione in immunofluorescenza degli epitopi di interesse⁶. La fissazione ritardata può indurre la degradazione proteolitica, che si traduce in una colorazione indebolita o assente degli epitopi critici⁷. Inoltre, gli anticorpi sono spesso imprecisi con alti livelli di background. I protocolli di immunocolorazione che promuovono un legame anticorpale coerente e specifico e un elevato rapporto segnale/rumore possono fornire informazioni preziose per i ricercatori.

In questo caso, forniamo un protocollo completo progettato per ottenere immagini di immunofluorescenza di alta qualità attraverso la fissazione del tessuto intestinale, la preparazione di rotoli svizzeri⁸ e l’immunocolorazione. Sottolineando le linee guida per preservare l’integrità dell’intestino, il protocollo mira a fornire ai ricercatori una solida metodologia per migliorare la qualità e l’affidabilità degli studi di imaging in immunofluorescenza. Abbiamo anche cercato di utilizzare risorse convenienti, tra cui carta da filtro e recupero dell’antigene fatto in casa, soluzioni bloccanti e diluenti anticorpali per rendere il protocollo più accessibile ai laboratori che potrebbero avere fondi limitati. Come per tutti i protocolli sperimentali, i ricercatori dovrebbero ottimizzare il protocollo attuale in base al loro approccio sperimentale e alle aree di interesse.

Protocol

Il Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali dell’Università di Medicina della Carolina del Sud ha approvato tutte le cure, il mantenimento e il trattamento degli animali. Il tessuto intestinale è stato raccolto da topi adulti C57BL/6J (maschi e femmine di età compresa tra 3 e 5 mesi, del peso di circa 30 g) per l’uso nel presente studio. 1. Fissazione del tessuto intestinale Sezionare con cura l’intero intestino di un topo soppresso e metterlo in u…

Representative Results

È stata eseguita la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), come precedentemente descritto12. Utilizzando il metodo ottimizzato, gli involtini intestinali svizzeri includevano tutti e tre i segmenti dell’intestino tenue e dell’intestino crasso in un unico vetrino. Avere l’intero intestino alloggiato su un vetrino consente ai ricercatori di analizzare i cambiamenti in tutte le parti dell’intestino e consente di risparmiare sui costi di sezionamento e colorazione dei reagenti (<strong class="…

Discussion

Qui presentiamo un metodo ottimizzato per la fissazione dei tessuti utilizzando la tecnica del rullo svizzero per preservare l’architettura intestinale e promuovere un’accurata immunocolorazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per indagare un’ampia varietà di domande di ricerca che coinvolgono la fisiologia intestinale e la biologia cellulare¹⁹. Sono stati pubblicati diversi metodi di laminazione svizzeri ottimizzati che sono molto utili^{20,21</sup…}

Materials

β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
Cellulose filter paper	Cytiva	10427804	Thick Whatman paper
Charged glass slides	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
Dissecting pins size 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R&D Systems	AF748
Freezer gloves	Tempshield	UX-09113-02
Heating block	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	Electron Microscopy Sciences	64111-04	Clearing reagent
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
Hydrophobic pen	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	Santa Cruz	SC-19992
Large cassettes	Tissue-Tek	4173
Minutien pins	Fine Science Tools	NC9679721
Mouse-on-mouse blocking reagent	Vector Laboratories	MKB-2213	Mouse-on-mouse block
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	Cell Signaling Technology	2586S
Pressure Cooker	Cuisinart	B000MPA044
ProLong gold antifade	Thermo Fisher Scientific	P36934	Mounting medium
Reverse action forceps	Dumont	5748
Slide Rack	Tissue-Tek	62543-06
Slide Staining Set	Tissue-Tek	62540-01	Solvent Resistant Dishes and Metal Frame
Small cassettes	Fisherbrand	15-200-403B
Sodium citrate dihydrate	Fisher Bioreagents	BP327-1
Teleostein Gelatin	Sigma	G7765	Blocking buffer
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	A16046
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
Wipes	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
γ-ACTIN	Santa Cruz	SC-65638