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Biochemistry

Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Ce protocole de fractionnement permettra aux chercheurs d’isoler des protéines cytoplasmiques, nucléaires, mitochondriales et membranaires à partir de cellules de mammifères. Les deux dernières fractions subcellulaires sont purifiées par gradient de densité isopycnique.

Abstract

Ce protocole décrit une méthode pour obtenir des fractions protéiques subcellulaires à partir de cellules de mammifères en utilisant une combinaison de détergents, de lyse mécanique et de centrifugation à gradient de densité isopycnique. L’avantage majeur de cette procédure est qu’elle ne repose pas sur l’utilisation exclusive de détergents solubilisants pour obtenir des fractions subcellulaires. Cela permet de séparer la membrane plasmique des autres organites liés à la membrane de la cellule. Cette procédure facilitera la détermination de la localisation des protéines dans les cellules avec une méthode reproductible, évolutive et sélective. Cette méthode a été utilisée avec succès pour isoler les protéines cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et plasmiques de la lignée cellulaire monocytaire humaine, U937. Bien qu’optimisée pour cette lignée cellulaire, cette procédure peut servir de point de départ approprié pour le fractionnement subcellulaire d’autres lignées cellulaires. Les pièges potentiels de la procédure et la façon de les éviter sont discutés, tout comme les modifications qui peuvent devoir être envisagées pour d’autres lignées cellulaires.

Introduction

Le fractionnement subcellulaire est une procédure dans laquelle les cellules sont lysées et séparées en leurs composants constitutifs par plusieurs méthodes. Cette technique peut être utilisée par les chercheurs pour déterminer la localisation des protéines dans les cellules de mammifères ou pour enrichir des protéines de faible abondance qui seraient autrement indétectables. Bien qu’il existe actuellement des méthodes de fractionnement subcellulaire, tout comme les kits commerciaux qui peuvent être achetés, ils souffrent de plusieurs limitations que cette procédure tente de surmonter. La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire sont exclusivement à base de détergent1,2, reposant sur l’utilisation de tampons contenant des quantités croissantes de détergent pour solubiliser différents composants cellulaires. Bien que cette méthode soit rapide et pratique, elle aboutit à des fractions impures. Ceux-ci sont conçus pour permettre aux chercheurs d’isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais ne sont pas assez complexes pour isoler plusieurs fractions subcellulaires d’un échantillon en même temps. Se fier uniquement aux détergents entraîne généralement une solubilisation indiscriminée des organites enfermés dans la membrane et de la membrane plasmique, ce qui rend la séparation de ces composants difficile. Une complication supplémentaire de l’utilisation de ces kits est l’incapacité des chercheurs à les modifier/optimiser pour des applications spécifiques, car la plupart des composants sont des formulations exclusives. Enfin, ces kits peuvent être d’un coût prohibitif, avec des limites dans le nombre d’utilisations qui les rendent moins qu’idéaux pour des échantillons plus volumineux.

Malgré la disponibilité de kits pour l’isolement des mitochondries qui ne dépendent pas de détergents, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et produire des quantités d’échantillon significativement inférieures aux protocoles d’isolement standard 3,4. Bien que les méthodes de centrifugation différentielle prennent plus de temps, elles aboutissent souvent à des fractions distinctes qui ne peuvent pas être obtenues avec des kits exclusivement à base de détergent1. La séparation sans utilisation exclusive de détergents solubilisants permet également une purification supplémentaire à l’aide d’ultracentrifugation et de gradients de densité isopycnique, ce qui réduit la contamination croisée. Ce protocole de fractionnement démontre l’isolement de fractions subcellulaires à partir de monocytes U937 en utilisant une combinaison d’approches basées sur la centrifugation à haute vitesse et les détergents. Cette méthode facilitera l’isolement des composants nucléaires, cytoplasmiques, mitochondriaux et plasmiques d’une cellule de mammifère avec une contamination minimale entre les fractions.

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Protocol

1. Préparer des tampons et des réactifs

  1. Préparer des solutions fraîches d’inhibiteurs de phosphatase et de protéase.
    1. Ajouter 17,4 mg de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) à 1 mL d’éthanol à 100 % pour préparer un stock de 100 mM.
      NOTA : Porter un équipement de protection lors de la manipulation du PMSF, car il est dangereux lorsqu’il est ingéré ou inhalé et lorsqu’il est en contact avec la peau ou les yeux. Il est corrosif pour les yeux et la peau.
    2. Selon les instructions du fabricant, préparez un cocktail d’inhibiteurs de protéase disponibles dans le commerce (100x).
    3. Ajouter 91,9 mg d’orthovanadate de sodium (SOV) à 1 mL d’eau désionisée pour préparer un bouillon de 500 mM.
      REMARQUE : Porter un équipement de protection lors de la manipulation du VSO, car il est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou au contact des yeux. Une surexposition grave peut entraîner la mort.
  2. Préparer le tampon de lyse A, le tampon d’isolement cytoplasmique (IC), le tampon de solubilisation cellulaire (CS), le tampon de lyse nucléaire (NL), le tampon de lyse B, le tampon d’homogénéisation cellulaire (CH), le diluant d’iodixanol et les détergents.
    1. Ajouter 8,7 g de chlorure de sodium (NaCl) et 50 mL d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES, 1 M, pH 7,4) à 950 mL d’eau désionisée pour préparer le tampon de lyse A (concentrations finales de 150 mM de NaCl et 50 mM HEPES).
    2. Préparer les solutions mères de détergents comme suit : ajouter 0,1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 1 % de SDS), ajouter 0,1 g de désoxycholate de sodium à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 1 %), ajouter 2,5 mg de digitonine à 10 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 250 μg/mL), et ajouter 1 mL de détergent non ionique et non dénaturant (voir le tableau des matières) à 9 mL de tampon de lyse A (concentration finale de 10 % (v/v)).
    3. Préparer le tampon d’IC en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM) et 100 μL de digitonine mère (250 μg/mL) à 878 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV et 25 μg/mL de digitonine). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
    4. Préparer le tampon CS en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM), 100 μL de stock de détergent non ionique et non dénaturant (voir le tableau des matières) (10 %) et 118 μL de stock d’hexylène glycol (8,44 M) à 760 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV, 1% non ionique, détergent non dénaturant et 1 M hexylène glycol). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
    5. Préparer le tampon NL en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM), 10 μL d’inhibiteur de protéase (100x), 2 μL de stock SOV (500 mM), 50 μL de stock de désoxycholate de sodium (10%), 100 μL de stock de FDS (1%) et 118 μL de stock d’hexylène glycol (8,44 M) à 710 μL de tampon de lyse A (concentrations finales de 1 mM PMSF, 1x inhibiteur de protéase, 1 mM SOV, 0,5% de désoxycholate de sodium (v / v), 0,1% SDS (p / v) et 1 M hexylène glycol). Gardez la solution sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille nucléaire.
    6. Ajouter 20 mL d’acide HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g de chlorure de potassium (KCl), 0,19 g de chlorure de magnésium (MgCl 2), 2 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (0,5 M EDTA),2 mL d’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N',N'-tétraacétique (0,5 M EGTA), 38,3 g de mannitol et 23,9 g de saccharose à 980 mL d’eau désionisée pour préparer le tampon de lyse B (concentrations finales de 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol et 70 mM saccharose).
    7. Préparer le tampon CH en ajoutant 10 μL de stock PMSF (100 mM) et 2 μL de stock SOV (500 mM) à 988 μL de tampon de lyse B (concentrations finales de 1 mM PMSF et 1 mM SOV; ajuster le volume final pour tenir compte du nombre de cellules lysées). Conserver la solution sur glace jusqu’à ce qu’elle soit ajoutée à la pastille de cellule.
    8. Préparer le diluant iodixanol par addition de 12 mL d’HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg de KCl, 114 g de MgCl 2, 1,2 mL de 0,5 M EDTA,1,2 mL de 0,5 M EGTA, 21,3 g de mannitol et 14,4 g de saccharose à 88 mL d’eau désionisée (concentrations finales de 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol et 420 mM saccharose).
    9. Conserver les tampons à 4 °C et la digitonine à -20 °C.

2. Isolement des protéines cytosoliques

NOTE: Les étapes suivantes permettront la croissance et l’expansion des cellules U937 suivies de l’extraction des protéines cytosoliques. À la concentration utilisée, la digitonine perméabilise la membrane plasmique sans la perturber, ce qui permet la libération de protéines cytosoliques et la rétention d’autres protéines cellulaires.

  1. Culture des cellules dans RPMI 1640 avec 10% de sérum fœtal bovin à 37 °C et 5% de CO2. Assurez-vous que les cellules sont cultivées jusqu’à un total final de 6 x 108 cellules.
    REMARQUE: Dans ce protocole, les cellules ont été comptées à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope standard.
  2. Centrifuger les cellules cultivées à 400 × g pendant 10 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL, et pipeter doucement pour briser les touffes.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min pour granuler les cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de lyse glacé A (préparé à l’étape 1.2.1) à une concentration finale de 2 × 107 cellules/mL.
  4. Retirer 7,5 mL des cellules en suspension dans le tampon de lyse A (3 × 107 cellules) et conserver la glace pour l’extraction des protéines nucléaires (section 6). Centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C, 400 × g pendant 10 min pour granuler les cellules.
    REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 °C ou sur de la glace, et prérefroidissez tous les tampons.
  5. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon CI à une concentration finale de 2 × 107 cellules/mL et pipeter doucement pour briser les touffes. Faire pivoter la suspension cellulaire bout à bout à 4 °C pendant 20 min.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 4 °C, 400 × g pendant 10 min, et transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre. Conservez la pastille cellulaire et stockez-la sur de la glace. Centrifuger le surnageant collecté à 4 °C, 18 000 × g pendant 20 min pour pelleter les débris cellulaires.
    REMARQUE: Cette étape de centrifugation à grande vitesse est essentielle pour prévenir la contamination de la fraction cytosolique par des organites et des protéines liées à la membrane.
  7. Jeter la pastille après avoir transféré le surnageant dans un tube à centrifuger propre. Répéter les deux étapes de centrifugation de l’étape 2.6 jusqu’à ce qu’aucune pastille ne soit obtenue après la centrifugation.
  8. Recueillir le surnageant, qui est la fraction cytosolique. Pour un stockage à court terme (1 mois), s’assurer que le surnageant est conservé à 4 °C. Pour une conservation à long terme (>1 mois), combiner le surnageant avec 1x tampon Laemmli contenant 1x agent réducteur, chauffer à 95 °C pendant 7 min et conserver à -20 ou -80°C.
  9. Resuspendre la pastille cellulaire (à partir de l’étape 2.6) dans le tampon de lyse A à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL; Pipeter doucement pour briser les touffes.

3. Homogénéisation cellulaire

NOTE: Les étapes suivantes permettront l’homogénéisation mécanique des cellules traitées à la digitonine (à partir de l’étape 2.9), ce qui est nécessaire pour l’isolement des fractions protéiques mitochondriales et membranaires.

  1. Centrifuger la suspension cellulaire dans le tampon de lyse A (préparé à l’étape 2.9), conserver la pastille et jeter le surnageant pour éliminer l’excès de digitonine et de contaminants cytosoliques de la pastille cellulaire.
    NOTE: Des lavages répétés dans le tampon de lyse A peuvent être effectués pour éliminer les contaminants cytosoliques en excès.
  2. Resuspendre la pastille cellulaire dans un tampon CH glacé (préparé à l’étape 1.2.7) à une concentration finale de 4 × 106 cellules/mL. Incuber la suspension cellulaire sur de la glace pendant 30 min.
  3. Si vous utilisez une méthode à base de billes pour la lyse mécanique, placer 30 g de perles d’acier inoxydable prélavées de 3,2 mm dans un tube à jupe de 50 mL, remplir avec 15 ml de tampon de lyse B et placer sur de la glace pour refroidir. Si vous utilisez un homogénéisateur Dounce (avec un pilon B bien ajusté), remplir avec un volume approprié de tampon de lyse B, insérer le pilon et le placer sur de la glace pour refroidir.
  4. Après l’incubation (étape 3.2), jeter le tampon de lyse B des tubes à billes (ou homogénéisateur de rebond) et transférer 15 mL de la suspension cellulaire dans le tube à billes (ou un volume approprié dans l’homogénéisateur).
  5. Si vous utilisez la méthode à base de billes, placez les tubes à billes à jupe contenant la suspension cellulaire dans le dispositif mélangeur et configurez pour fonctionner pendant 5 minutes à la vitesse 8. Si vous utilisez un homogénéisateur Dounce, gardez-le sur la glace et effectuez 40 passages avec le pilon en utilisant des coups lents et réguliers (ou utilisez une autre méthode de lyse cellulaire mécanique comme détaillé dans la section de discussion).
    REMARQUE: Si vous utilisez un mélangeur différent de celui utilisé ici, la vitesse et le temps peuvent devoir être déterminés empiriquement.
  6. Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger propre et le centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube centrifuge propre et économiser; Jetez la pastille.
    NOTE: Le protocole peut être interrompu ici et l’homogénat stocké à 4 °C à court terme (24 h).

4. Enlèvement des débris et isolement des fractions mitochondriales et membranaires brutes

NOTE: Les étapes suivantes permettront d’éliminer les débris cellulaires en centrifugeant l’homogénat à des vitesses croissantes. Ceci est suivi par centrifugation différentielle pour l’isolement des fractions mitochondriales et membranaires brutes.

  1. Centrifuger l’homogénat (à partir de l’étape 3.6) à 500 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
  2. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.1) à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
  3. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.2) à 2 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter toute pastille.
  4. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.3) à 4 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube centrifuge propre et conserver la pastille, qui est la fraction mitochondriale brute.
  5. Centrifuger le surnageant (à partir de l’étape 4.4) à 18 000 × g pendant 1 h à 4 °C. Jetez le surnageant et conservez la pastille, qui est la fraction membranaire brute.
    NOTE: Le protocole peut être interrompu ici, et les échantillons granulés stockés à 4 ° C à court terme (24 h).

5. Purification du gradient de densité isopycnique

REMARQUE: Les étapes suivantes utilisent la centrifugation du gradient de densité isopycnique pour purifier les fractions mitochondriales et membranaires brutes.

  1. Préparer une solution de travail à 50 % (v/v) d’iodixanol en mélangeant 1 partie de diluant (préparé à l’étape 1.1.3) à 5 parties d’iodixanol ( solution mère à 60 % (p/v)). Préparer des solutions d’iodixanol à 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % et 35 % (v/v) en mélangeant une solution de travail à 50 % (v/v) avec un tampon de lyse B en quantités appropriées.
  2. Remettez en suspension les pastilles mitochondriales et membranaires brutes (des étapes 4.4 et 4.5) chacune dans 200 μL de tampon de lyse B. Ajuster à 45% iodixanol (v / v) en ajoutant 1800 μL de solution d’iodixanol de travail (50% (v / v)) à 200 μL de la pastille remise en suspension.
  3. Créer un gradient discontinu d’iodixanol comme suit (ajuster les volumes en fonction de la capacité du tube à ultracentrifugeuse) : Ajouter 1 mL d’iodixanol à 15 % (v/v) au bas d’un tube à ultracentrifugation à paroi mince à dessus ouvert de 8 mL, placer 1 mL d’iodixanol à 20 % (v/v) sous la première couche (par la technique de sous-couche), suivi d’une couche de sous-couche de 1 mL de 25 %, 1 mL de 30 % et 1 mL d’iodixanol à 35 % (v/v).
    NOTE: Il devrait y avoir 2 gradients créés à cette étape, 1 pour la fraction mitochondriale et 1 pour la fraction membranaire.
  4. Dans 1 gradient, ajouter les 2 mL de la pastille mitochondriale brute (en suspension dans 45% d’iodixanol (v/v)) en utilisant la technique de sous-couche au fond du tube sous l’iodixanol à 35% (v/v). Dans l’autre gradient, ajouter les 2 mL de la pastille de membrane brute (en suspension dans de l’iodixanol à 45 % (v/v)) en utilisant la technique de sous-couche au fond du tube sous l’iodixanol à 35 % (v/v).
  5. Ajouter 1 mL d’iodixanol à 10 % (v/v) au sommet de chaque tube de gradient en le superposant sur la couche à 15 %. Équilibrer les tubes à moins de 0,1 g l’un de l’autre par l’ajout de 10% d’iodixanol (v / v).
  6. Faire tourner les tubes de gradient de densité à 4 °C pendant 18 h à 100 000 × g. Assurez-vous de régler l’accélération et la décélération sur les valeurs minimales de l’ultracentrifugeuse utilisée.
    REMARQUE: Dans le gradient mitochondrial, il y aura une bande visible à l’interface entre 25% et 30% iodixanol (v / v). C’est la fraction mitochondriale pure. Dans le gradient membranaire, il y aura une bande visible dans la fraction iodixanol (v/v) à 15%. C’est la fraction membranaire pure. Il peut y avoir des bandes supplémentaires dans les fractions d’iodixanol (v/v) à 25 % et à 30 % dans le gradient membranaire. C’est la contamination mitochondriale.
  7. Recueillir les fractions du haut du tube dans des aliquotes de 1 mL, en prenant soin de minimiser le volume de la fraction contenant les bandes visibles et en changeant l’extrémité de la pipette après la collecte de chaque couche. Alternativement, percez le côté du tube à paroi mince avec une aiguille et recueillez les bandes visibles.
  8. Conservez les échantillons comme décrit à l’étape 2.8 jusqu’à la vérification par dosage des protéines et transfert Western.

6. Isolement des protéines nucléaires

REMARQUE: En utilisant des détergents ioniques et non ioniques ainsi que des techniques telles que la sonication et la centrifugation, les étapes suivantes solubilisent toutes les membranes cellulaires et permettent l’isolement des protéines nucléaires.

  1. Centrifuger les 7,5 mL aliquotes de cellules en suspension dans le tampon de lyse A (à partir de l’étape 2.4) et jeter le surnageant. Ajouter 800 μL de tampon CS glacé (préparé à l’étape 1.2.4) et remettre la pastille en suspension par pipetage et vortex. Incuber les échantillons sur de la glace (ou à 4 °C) pendant 30 min pour perturber les membranes plasmatiques et organites tout en protégeant les protéines nucléaires.
  2. Centrifuger la suspension cellulaire à 7 000 × g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 800 μL de tampon NL glacé (préparé à l’étape 1.2.5) à la pastille nucléaire après inclusion de benzonase 1U/μL. Remettez le granulé en suspension en le pipetant doucement. Incuber sur un rotateur bout à bout pendant 30 minutes à 4 °C pour perturber la membrane nucléaire.
  3. Sonicate pendant 5 s à 20% de puissance avec des tubes d’échantillon refroidis dans un bain de glace (3x, avec des pauses de 5 s entre les impulsions), qui, avec la benzonase (ajoutée à l’étape 6.2), cisaillera les acides nucléiques.
  4. Centrifuger le sonicate à 7 800 × g pendant 10 min à 4 °C. Collectez et sauvez le surnageant, qui est la fraction nucléaire. Assurez-vous de ne pas déranger la pastille insoluble lors de la collecte du surnageant. Pour le stockage, des échantillons peuvent être préparés comme décrit à l’étape 2.8.

7. Quantification des protéines et analyse Western blot

REMARQUE: Les étapes suivantes quantifieront les protéines totales dans chaque fraction et confirmeront la pureté des fractions subcellulaires.

  1. Effectuer un test de Bradford standard pour quantifier la protéine totale dans chaque fraction. Se reporter au tableau 1 pour connaître les rendements en protéines prévus.
    REMARQUE: D’autres dosages protéiques tels que le dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou l’absorbance à 280 nm peuvent être utilisés pour mesurer les protéines totales à la place d’un test Bradford.
  2. Combiner les fractions avec 1x tampon Laemmli contenant 1x agent réducteur et chauffer à 95 °C pendant 7 min. Charger 10 μg de chaque fraction dans un gel standard d’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (PAGE) et faire fonctionner le gel à 20 mA pendant 1 h.
  3. Transférer les protéines résolues sur une membrane de polyfluorure de vinyle (PVDF) en effectuant un transfert immunoblot standard à 100 V pendant 30 min. Bloquer la membrane PVDF avec du lait à 5% dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1% d’un détergent non ionique (v / v) pendant 30 minutes à température ambiante.
  4. Ajouter les anticorps primaires appropriés pour détecter les protéines ménagères spécifiques à chaque fraction subcellulaire et incuber pendant une nuit à 4 °C. Laver la membrane avec du lait 5% dans 1x TBS contenant 0,1% de détergent non ionique (v / v) pendant 10 minutes à température ambiante.
    REMARQUE: Pour ce protocole, des anticorps contre la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH, 1:10000), l’histone H3 (1:2000), le canal anionique voltage-dépendant (VDAC, 1:1000) et la Na,K+-ATPase ont été utilisés pour les fractions cytosolique, nucléaire, mitochondriale et membranaire, respectivement.
  5. Ajouter les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) appropriés à la membrane (diluer selon les instructions du fabricant) et incuber à température ambiante pendant 1 h. Laver la membrane avec du lait 5% dans 1x TBS contenant 0,1% de détergent non ionique (v / v) pendant 10 minutes à température ambiante. Développer le transfert en utilisant la chimiluminescence standard.

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Representative Results

Un organigramme schématique de cette procédure (Figure 1) résume visuellement les étapes qui ont été suivies pour fractionner avec succès les cellules U9375 cultivées en suspension. Les fractions recueillies au sommet du gradient de densité isopycnique en volumes égaux (1 mL) montrent la purification des fractions mitochondriale et membranaire (Figure 2). L’utilisation d’un anticorps contre VDAC, une protéine localisée à la membrane mitochondriale externe6, montre que la fraction mitochondriale a migré vers les fractions 25% et 30% iodixanol (v/v) (Figure 2A). L’utilisation d’un anticorps contre la sous-unité Na,K+-ATPase α1, partie d’un hétérodimère membranaire intégral trouvé principalement dans la membrane plasmique7, montre la séparation de la contamination membranaire de la fraction mitochondriale pure (Figure 2A). La fraction membranaire pure a migré vers les fractions les moins denses, 10 % et 15 % d’iodixanol (v/v) (figure 2B). La contamination mitochondriale de la fraction membranaire a été séparée par le gradient.

Un Western blot8 réalisé avec les marqueurs de localisation supplémentaires (référencés à l’étape 7.4) montre la pureté des fractions cytosoliques et nucléaires, tout en vérifiant que les échantillons mitochondriaux et membranaires sont exempts de contamination par des protéines provenant d’autres parties de la cellule (Figure 3). L’utilisation d’un anticorps contre le GAPDH, normalement localisé au cytoplasme de la cellule9, montre que cette protéine ne se trouve que dans la fraction cytosolique (Figure 3A, Lane 1, premier panneau), et qu’aucune contamination n’est observée dans les protéines nucléaires extraites, les mitochondries purifiées en densité, ou les fractions membranaires (Figure 3A ; voies 2, 3 et 4; premier panneau). Le sondage de l’histone H3, une protéine présente dans le noyau et impliquée dans la structure de la chromatine10, montre une extraction nucléaire réussie (Figure 3A, Lane 2, deuxième panneau), avec une détection minimale dans la fraction cytoplasmique et aucune contamination croisée dans les fractions mitochondriales ou membranaires.

Le sondage du VDAC dans toutes les fractions montre la présence de cette protéine dans la fraction mitochondriale pure (Figure 3A, Lane 3, troisième panneau), et qu’aucune contamination croisée n’existe dans les autres fractions (Figure 3A ; voies 1, 2 et 4; troisième panel). Le sondage de la sous-unité Na/K-ATPase α1 montre également que cette protéine n’est située que dans la fraction membranaire pure (Figure 3A, Lane 4, quatrième panneau). Ces fractions ont été analysées par densitométrie pour confirmer la reproductibilité et la signification statistique (figure 3B-E). Contrairement aux résultats du fractionnement réussi (Figure 3), une mauvaise exécution de cette méthode (ou le non-respect de toutes les étapes recommandées) peut entraîner une contamination croisée des composants cellulaires (Figure 4). Une concentration élevée d’histone H3 dans la fraction cytosolique (figure 4, voie 1, deuxième panneau) peut résulter d’une incapacité à clarifier correctement la fraction cytosolique (référencée à l’étape 2.6). Cela peut se produire si les spins de centrifugation de clarification ne sont pas suffisants ou si la fraction cytosolique n’est pas clarifiée rapidement. Si la fraction cytosolique n’est pas clarifiée assez rapidement, il peut en résulter une lyse des fragments cellulaires, entraînant une contamination de la fraction cytosolique.

L’absence d’étape de purification de la densité isopycnique entraînera une contamination de la fraction membranaire (figure 4, voie 4, tous les panneaux), selon l’hétérogénéité de l’échantillon avant la purification de la densité. Le respect correct de toutes les étapes du protocole est essentiel pour obtenir la séparation souhaitée des fractions subcellulaires. Lorsqu’il est quantifié à l’aide d’un test de Bradford, le rendement en protéines pour chaque fraction peut être déterminé. Le rendement protéique attendu par fraction est indiqué dans le tableau 1. Il est utile d’effectuer un test de quantification des protéines avant d’effectuer des transferts Western pour plusieurs raisons. Premièrement, il confirme que les fractions contiennent effectivement des protéines; deuxièmement, il permet le chargement des gels SDS-PAGE en fonction de la quantité de protéines; et enfin, en supposant que les rendements en protéines sont similaires à ceux attendus (tableau 1), cela confirme la bonne exécution de la procédure.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la procédure de fractionnement des cellules. Vue d’ensemble du protocole de fractionnement des cellules représenté sous forme d’organigramme. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; CS = solubilisation cellulaire; NL = lyse nucléaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Purification de la densité isopycnique des fractions mitochondriales et membranaires brutes. (A) Transfert Western représentatif de toutes les fractions recueillies après purification par gradient de densité de la fraction mitochondriale brute. (B) Transfert Western représentatif de toutes les fractions prélevées après purification par gradient de densité de la fraction membranaire brute. Les deux purifications du gradient de densité montrent la migration du marqueur mitochondrial, VDAC, pour les fractions iodixanol (v/v) à 25 % et 30 % et la migration du marqueur membranaire, Na,K+ ATPase, pour les fractions d’iodixanol (v/v) à 10 % et 15 %. Abréviation : VDAC = canal anionique dépendant de la tension. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Isolement réussi des fractions cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et membranaires de l’U937. (A) Transferts Western représentatifs de fractions cellulaires isolées d’une culture cellulaire U937 avec cette technique et sondées pour les marqueurs du cytoplasme (GAPDH, premier panel), du noyau (Histone H3, deuxième panel), des mitochondries (VDAC, troisième panneau) et de la membrane (Na,K+ ATPase α1, quatrième panel). (B-E) Densitométrie de Western blots de fractions cellulaires isolées à partir de cultures cellulaires U937 avec cette technique. Les résultats proviennent de 3 expériences indépendantes. Les barres d’erreur représentent l’écart type. ANOVA à sens unique. p<0,001. Abréviations : GAPDH = glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase; VDAC = canal anionique dépendant de la tension; cyto = cytosolique; nuc = nucléaire; mito = mitochondrial; mem = membrane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Fractionnement incomplet des composants des cellules U937. Transferts Western représentatifs de fractions cellulaires isolées à partir d’une culture cellulaire U937 montrant une contamination de la fraction cytosolique par l’histone H3 (voie 1, deuxième panneau) en raison d’une clarification inadéquate de cette fraction et d’une fraction membranaire brute qui n’a pas été soumise à une purification par gradient de densité isopycnique (voie 4, tous les panneaux). Abréviations : cyto = cytosolique; nuc = nucléaire; mito = mitochondrial; mem = membrane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fraction Rendement (μg/mL) Écart type Volume approximatif
Cytoplasme 1500 146 5 mL
Noyau 1200 172 500 μL
Mitochondrie 400 66 500 μL
Membrane 200 23 500 μL

Tableau 1 : Rendement en protéines pour chaque fraction subcellulaire.

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Discussion

Cette méthode est une version modifiée d’une approche précédemment publiée du fractionnement subcellulaire sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse11. Cette méthode modifiée nécessite un équipement plus spécialisé pour obtenir les meilleurs résultats, mais elle est plus complète et reproductible de façon cohérente.

Le développement du protocole initial était nécessaire en raison de l’incapacité de séparer les échantillons mitochondriaux et membranaires pour l’analyse de la localisation des protéines au cours de la nécroptose12. Les tentatives d’utiliser les méthodes exclusivement à base de détergent que l’on trouve dans la plupart des trousses disponibles dans le commerce ont abouti à un mélange homogène contenant la membrane plasmique et tous les organites enfermés dans la membrane dans la cellule. Parmi les autres limites de ces trousses figurent l’incapacité d’apporter des modifications à la procédure, le coût par échantillon, les restrictions de volume et le nombre d’échantillons pouvant être traités. La procédure présentée ici peut être modifiée à n’importe quelle échelle, modifiée pour isoler moins de fractions et peut être effectuée sans l’utilisation de réactifs coûteux. Les rendements en fractions peuvent être augmentés en utilisant plus de cellules; les étapes peuvent être adaptées à la recherche effectuée; et l’exécution de la méthode est flexible. Par exemple, si les chercheurs n’examinent pas une fraction subcellulaire particulière, ils n’ont pas besoin d’isoler cet échantillon au cours de la procédure. De même, l’ajout d’inhibiteurs ou de réactifs particuliers peut être omis si le chercheur ne prévoit pas étudier l’état de phosphorylation des protéines (orthovanadate de sodium) ou ne se préoccupe pas de la dénaturation des protéines (hexylène glycol).

L’utilisation de l’iodixanol comme solution de gradient de densité est facultative; Cependant, ce réactif n’interfère pas avec l’examen ultérieur des échantillons par transfert Western. Il est également possible d’éliminer l’iodaxanol des échantillons par dilution et centrifugation pour récupérer les mitochondries ou la membrane, bien que cela affecte le rendement final. D’autres solutions alternatives de gradient de densité peuvent être utilisées, y compris le saccharose. Pour obtenir des résultats optimaux et des fractions pures, il y a plusieurs facteurs à considérer, et des étapes critiques particulières dans le protocole qui nécessitent une attention particulière. Ce protocole est optimisé pour le fractionnement des cellules U937, et la concentration de cellules recommandée à des points particuliers du protocole est spécifique à cette lignée cellulaire. Ces valeurs ont été déterminées empiriquement et devront probablement être ajustées pour différents types de cellules, en particulier si des résultats sous-optimaux sont obtenus lors de l’exécution du protocole.

La clarification de l’échantillon cytoplasmique devrait avoir lieu dès que possible pour éliminer les cellules intactes et les débris qui pourraient entraîner une contamination croisée par des protéines provenant d’autres fractions subcellulaires (Figure 4, Lane 1, deuxième panneau). L’homogénéisation peut être réalisée avec n’importe quelle forme de lyse mécanique, bien que les résultats présentés ici aient été obtenus à l’aide d’une méthode à base de billes et d’un dispositif mélangeur. D’autres formes manuelles d’homogénéisation (un homogénéisateur Dounce ou un passage à travers une aiguille de petit calibre) peuvent également être utilisées, mais peuvent entraîner des problèmes de reproductibilité en raison de la variabilité de la technique par la personne effectuant la procédure. L’intérêt de ce groupe est principalement dans les leucocytes circulants, c’est pourquoi les cellules U937 sont utilisées dans cette procédure. Cependant, cette procédure peut être appliquée à d’autres lignées cellulaires en suspension avec probablement peu besoin de modification. Les portions qui peuvent avoir besoin d’être ajustées pour s’adapter à une autre lignée cellulaire en suspension comprennent les concentrations cellulaires utilisées tout au long de la procédure ainsi que la concentration de digitonine utilisée pour extraire la fraction cytosolique.

Bien qu’elle ne soit pas optimisée pour les lignées cellulaires adhérentes, cette procédure peut servir de point de départ pour des ajustements pouvant être apportés pour accueillir les cellules adhérentes. Ces ajustements comprennent la concentration cellulaire, la concentration de digitonine et le temps d’homogénéisation. De plus, les cellules adhérentes sont limitées par la surface tandis que les cellules en suspension sont limitées par le volume; Cela simplifie la mise à l’échelle des cellules en suspension. Pour mettre à l’échelle les cellules adhérentes, il faut utiliser des plaques de culture tissulaire d’une grande surface (>500 cm2). Cette procédure est un fractionnement subcellulaire rentable et reproductible avec la capacité de séparer les fractions cytosoliques, nucléaires, mitochondriales et membranaires avec une grande pureté. L’un des plus grands avantages de cette procédure est la séparation de la fraction mitochondriale de la membrane de la membrane. Cela n’est pas possible dans les procédures exclusivement à base de détergent. Bien que des détergents soient utilisés dans cette procédure, ils sont utilisés pour perméabiliser, mais pas perturber la membrane plasmique (digitonine) et pour obtenir la fraction nucléaire après l’isolement des fractions mitochondriale et membranaire.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NIH R15-HL135675-01 et NIH 2 R15-HL135675-02 à T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

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References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
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  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Biochimie numéro 174 Fractionnement cellulaire nucléaire mitochondries membrane cytoplasme organites ultracentrifugation gradient de densité U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

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William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Fractionnement cellulaire de cellules U937 par purification par gradient de densité isopycnique
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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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