Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

Summary

Detta fraktioneringsprotokoll gör det möjligt för forskare att isolera cytoplasmatiska, nukleära, mitokondriella och membranproteiner från däggdjursceller. De två senare subcellulära fraktionerna renas ytterligare via isopycnic densitetsgradient.

Abstract

Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla subcellulära proteinfraktioner från däggdjursceller med användning av en kombination av tvättmedel, mekanisk lys och isopycnic densitetsgradientcentrifugering. Den största fördelen med denna procedur är att den inte är beroende av den enda användningen av solubiliserande tvättmedel för att erhålla subcellulära fraktioner. Detta gör det möjligt att separera plasmamembranet från andra membranbundna organeller i cellen. Denna procedur kommer att underlätta bestämningen av proteinlokalisering i celler med en reproducerbar, skalbar och selektiv metod. Denna metod har framgångsrikt använts för att isolera cytosoliska, nukleära, mitokondriella och plasmamembranproteiner från den humana monocytcellinjen, U937. Även om den är optimerad för denna cellinje kan denna procedur fungera som en lämplig utgångspunkt för subcellulär fraktionering av andra cellinjer. Potentiella fallgropar i förfarandet och hur man undviker dem diskuteras liksom förändringar som kan behöva övervägas för andra cellinjer.

Introduction

Subcellulär fraktionering är ett förfarande där celler lyseras och separeras i sina beståndsdelar genom flera metoder. Denna teknik kan användas av forskare för att bestämma proteinlokalisering i däggdjursceller eller för anrikning av proteiner med låg förekomst som annars inte skulle kunna upptäckas. Även om det för närvarande finns metoder för subcellulär fraktionering, liksom kommersiella kit som kan köpas, lider de av flera begränsningar som denna procedur försöker övervinna. De flesta cellfraktioneringsmetoder är uteslutande tvättmedelsbaserade^1,2, beroende av användning av buffertar som innehåller ökande mängder tvättmedel för att solubilisera olika cellulära komponenter. Även om denna metod är snabb och bekväm, resulterar den i orena fraktioner. Dessa är utformade för att göra det möjligt för forskare att enkelt isolera en eller två komponenter i cellen, men är inte tillräckligt komplexa för att isolera flera subcellulära fraktioner från ett prov samtidigt. Att enbart förlita sig på tvättmedel resulterar vanligtvis i membranslutna organeller och plasmamembranet som urskillningslöst lösgörs, vilket gör separationen av dessa komponenter svår. En ytterligare komplikation från användningen av dessa kit är forskarnas oförmåga att ändra / optimera dem för specifika applikationer, eftersom de flesta komponenterna är proprietära formuleringar. Slutligen kan dessa kit vara oöverkomligt dyra, med begränsningar i antalet användningsområden som gör dem mindre än idealiska för större prover.

Trots tillgången på kit för isolering av mitokondrier som inte är beroende av tvättmedel är de inte utformade för att isolera plasmamembranet och ge betydligt lägre mängder prov än standardisoleringsprotokoll ^3,4. Även om differentialcentrifugeringsmetoder är mer tidskrävande, resulterar de ofta i distinkta fraktioner som inte kan erhållas med uteslutande tvättmedelsbaserade kit¹. Separation utan enbart användning av solubiliserande tvättmedel möjliggör också ytterligare rening med ultracentrifugering och isopycnic densitetsgradienter, vilket resulterar i mindre korskontaminering. Detta fraktioneringsprotokoll visar isoleringen av subcellulära fraktioner från U937-monocyter med användning av en kombination av tvättmedels- och höghastighetscentrifugeringsbaserade metoder. Denna metod kommer att underlätta isoleringen av kärn-, cytoplasmatiska, mitokondriella och plasmamembrankomponenterna i en däggdjurscell med minimal förorening mellan fraktionerna.

Protocol

1. Förbered buffertar och reagenser

1. Förbered färska lösningar av fosfatas och proteashämmare.
   1. Tillsätt 17,4 mg fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) till 1 ml 100 % etanol för att bereda en 100 mM stam.
      OBS: Använd skyddsutrustning vid hantering av PMSF eftersom det är farligt vid förtäring eller inandning och vid kontakt med hud eller ögon. Det är frätande för ögon och hud.
   2. Enligt tillverkarens instruktioner, förbered en kommersiellt tillgänglig proteashämmare cocktail (100x).
   3. Tillsätt 91,9 mg natriumortovanadat (SOV) till 1 ml avjoniserat vatten för att bereda en 500 mM stam.
      OBS: Använd skyddsutrustning vid hantering av SOV eftersom det är farligt vid förtäring, inandning eller vid kontakt med ögonen. Allvarlig överexponering kan leda till döden.
2. Förbered lysbuffert A, cytoplasmatisk isolering (CI) buffert, celllöslighet (CS) buffert, kärnlys (NL) buffert, lysbuffert B, cellhomogenisering (CH) buffert, jodixanol spädningsmedel och tvättmedel.
   1. Tillsätt 8,7 g natriumklorid (NaCl) och 50 ml 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES, 1 M, pH 7,4) till 950 ml avjoniserat vatten för att bereda lysbuffert A (slutliga koncentrationer av 150 mM NaCl och 50 mM HEPES).
   2. Förbered stamlösningar av tvättmedel enligt följande: tillsätt 0,1 g natriumdodecylsulfat (SDS) till 10 ml lysbuffert A (slutlig koncentration av 1% SDS), tillsätt 0,1 g natriumdeoxikolat till 10 ml lysbuffert A (slutlig koncentration på 1%), tillsätt 2,5 mg digitonin till 10 ml lysbuffert A (slutlig koncentration på 250 μg / ml), och tillsätt 1 ml icke-joniskt, icke-denaturerande tvättmedel (se materialförteckningen) till 9 ml lysbuffert A (slutlig koncentration på 10 % (v/v)).
   3. Bered CI-buffert genom att tillsätta 10 μL PMSF-stam (100 mM), 10 μL proteashämmare (100x), 2 μL SOV-stam (500 mM) och 100 μL stam digitonin (250 μg/ml) till 878 μl lysbuffert A (slutliga koncentrationer av 1 mM PMSF, 1x proteashämmare, 1 mM SIV och 25 μg/ml digitonin). Håll lösningen på is tills den tillsätts till cellpellet.
   4. Bered CS-buffert genom att tillsätta 10 μL PMSF-stam (100 mM), 10 μL proteashämmare (100x), 2 μL SOV-stam (500 mM), 100 μl icke-jonisk, icke-denaturerande tvättmedelsstam (se materialförteckningen) (10 %) och 118 μl hexylenglykolstam (8,44 M) till 760 μL lysbuffert A (slutliga koncentrationer av 1 mM PMSF, 1x proteashämmare, 1 mM SOV, 1% icke-jonisk, icke-denaturerande tvättmedel och 1 M hexylenglykol). Håll lösningen på is tills den tillsätts till cellpellet.
   5. Bered NL-buffert genom att tillsätta 10 μl PMSF-stam (100 mM), 10 μl proteashämmare (100x), 2 μl SOV-stam (500 mM), 50 μl natriumdeoxikolatstam (10%), 100 μl SDS-stam (1%) och 118 μl hexylenglykolstam (8,44 M) till 710 μL lysbuffert A (slutliga koncentrationer av 1 mM PMSF, 1x proteashämmare, 1 mM SOV, 0,5% natriumdeoxikolat (v / v), 0,1% SDS (w / v) och 1 M hexylenglykol). Håll lösningen på is tills den tillsätts till kärnpellets.
   6. Tillsätt 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g kaliumklorid (KCl), 0,19 g magnesiumklorid (MgCl2), 2 ml etylendiamintetraättiksyra (0,5 M EDTA), 2 ml etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'tetraättiksyra (0,5 M EGTA_), 38,3 g mannitol och 23,9 g sackaros till 980 ml avjoniserat vatten för att bereda lysbuffert B (slutliga koncentrationer av 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol och 70 mM sackaros).
   7. Bered CH-buffert genom att tillsätta 10 μL PMSF-lager (100 mM) och 2 μL SOV-lager (500 mM) till 988 μL lysbuffert B (slutliga koncentrationer av 1 mM PMSF och 1 mM SOV; justera den slutliga volymen för att rymma antalet celler som lyser). Håll lösningen på is tills den tillsätts till cellpellet.
   8. Förbered iodixanolutspädningsmedel genom tillsats av 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g MgCl2, 1,2 ml 0,5 M EDTA, 1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g mannitol och 14,4 g sackaros till 88 ml avjoniserat vatten (slutliga koncentrationer av 120 mM HEPES_, 60 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol och 420 mM sackaros).
   9. Lagra buffertar vid 4 °C och digitonin vid -20 °C.

2. Cytosolisk proteinisolering

OBS: Följande steg möjliggör tillväxt och expansion av U937-celler följt av extraktion av cytosoliska proteiner. Vid den använda koncentrationen kommer digitonin att permeabilisera plasmamembranet utan att störa det, vilket möjliggör frisättning av cytosoliska proteiner och retention av andra cellulära proteiner.

1. Odla cellerna i RPMI 1640 med 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C och 5% CO₂. Se till att cellerna odlas till en slutlig summa på 6 x 10⁸ celler.
   OBS: I detta protokoll räknades celler med hjälp av en standard hemocytometer och mikroskop.
2. Centrifugera de odlade cellerna vid 400 × g i 10 minuter. Efter att ha kastat supernatanten, återsuspendera cellpelleten i rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en slutlig koncentration av 4 × 10⁶ celler / ml och pipettera försiktigt för att bryta upp klumpar.
3. Centrifugera cellsuspensionen vid 400 × g i 10 minuter för att pelletera cellerna. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i iskall lysbuffert A (beredd i steg 1.2.1) i en slutlig koncentration av 2 × 10⁷ celler/ml.
4. Ta bort 7,5 ml av cellerna suspenderade i lysbuffert A (3 × 10⁷ celler) och håll på is för kärnproteinextraktion (avsnitt 6). Centrifugera cellsuspensionen vid 4 °C, 400 × g i 10 minuter för att pelletera cellerna.
   OBS: Utför alla efterföljande steg vid 4 °C eller på is och förkyl alla buffertar.
5. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i CI-buffert i en slutlig koncentration av 2 × 10⁷ celler/ml och pipettera försiktigt för att bryta upp klumpar. Vrid cellsuspensionen från ände till ände vid 4 °C i 20 minuter.
6. Centrifugera cellsuspensionen vid 4 °C, 400 × g i 10 minuter och överför supernatanten till ett rent centrifugrör. Spara cellpelleten och förvara på is. Centrifugera den uppsamlade supernatanten vid 4 °C, 18 000 × g i 20 minuter till pelletsrester.
   OBS: Detta höghastighetscentrifugeringssteg är avgörande för att förhindra kontaminering av den cytosoliska fraktionen med organell och membranbundna proteiner.
7. Kassera pelleten efter överföring av supernatanten till ett rent centrifugrör. Upprepa båda centrifugeringsstegen i steg 2.6 tills ingen pellet erhålls efter centrifugering.
8. Samla supernatanten, som är den cytosoliska fraktionen. För kortvarig lagring (1 månad), se till att supernatanten förvaras vid 4 °C. För långtidsförvaring (>1 månad), kombinera supernatanten med 1x Liemmli-buffert innehållande 1x reduktionsmedel, värm vid 95 °C i 7 minuter och förvara vid -20 eller -80 °C.
9. Återsuspendera cellpelleten (från steg 2.6) i lysbuffert A i en slutlig koncentration av 4 × 10⁶ celler/ml. pipett försiktigt för att bryta upp klumpar.

3. Cellhomogenisering

OBS: Följande steg möjliggör mekanisk homogenisering av digitoninbehandlade celler (från steg 2.9), vilket är nödvändigt för isolering av mitokondriella och membranproteinfraktioner.

1. Centrifugera cellsuspensionen i lysbuffert A (beredd i steg 2.9), spara pelleten och kassera supernatanten för att avlägsna överskott av digitonin och cytosoliska föroreningar från cellpelleten.
   OBS: Upprepade tvättar i lysbuffert A kan utföras för att avlägsna överskott av cytosoliska föroreningar.
2. Återsuspendera cellpelleten i iskall CH-buffert (beredd i steg 1.2.7) vid en slutlig koncentration av 4 × 10⁶ celler/ml. Inkubera cellsuspensionen på is i 30 minuter.
3. Om du använder en pärlbaserad metod för mekanisk lysning, placera 30 g förtvättat 3,2 mm pärlor i rostfritt stål i ett 50 ml kjolrör, fyll med 15 ml lysbuffert B och lägg på is för att kyla. Om du använder en Dounce-homogenisator (med en tätt passande B-stöt), fyll med en lämplig volym lysbuffert B, sätt in stöten och lägg på is för att kyla.
4. Efter inkubation (steg 3.2), kassera lysbuffert B från pärlrören (eller Dounce-homogenisatorn) och överför 15 ml av cellsuspensionen till pärlröret (eller en lämplig volym till homogenisatorn).
5. Om du använder den pärlbaserade metoden, placera de kjolade pärlrören som innehåller cellsuspensionen i mixeranordningen och konfigurera för att köra i 5 minuter med hastighet 8. Om du använder en Dounce-homogenisator, håll den på is och utför 40 pass med stöten med långsamma, jämna slag (eller använd en alternativ metod för mekanisk celllys som beskrivs i diskussionsavsnittet).
   OBS: Om du använder en annan mixerenhet än den som används här kan hastighet och tid behöva bestämmas empiriskt.
6. Överför homogenatet till ett rent centrifugrör och centrifugera det vid 400 × g i 10 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent centrifugrör och spara; Kassera pelleten.
   OBS: Protokollet kan pausas här och homogenatet lagras vid 4 °C på kort sikt (24 timmar).

4. Avlägsnande av skräp och isolering av råa mitokondriella och membranfraktioner

OBS: Följande steg möjliggör avlägsnande av cellulärt skräp genom att centrifugera homogenatet med ökande hastigheter. Detta följs av differentiell centrifugering för isolering av råa mitokondriella och membranfraktioner.

1. Centrifugera homogenatet (från steg 3.6) vid 500 × g i 10 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent centrifugrör och kassera eventuell pellets.
2. Centrifugera supernatanten (från steg 4.1) vid 1 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent centrifugrör och kassera eventuell pellets.
3. Centrifugera supernatanten (från steg 4.2) vid 2 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent centrifugrör och kassera eventuell pellets.
4. Centrifugera supernatanten (från steg 4.3) vid 4 000 × g i 20 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent centrifugrör och spara pelleten, som är den råa mitokondriella fraktionen.
5. Centrifugera supernatanten (från steg 4.4) vid 18 000 × g i 1 timme vid 4 °C. Kassera supernatanten och spara pelleten, som är råmembranfraktionen.
   OBS: Protokollet kan pausas här och de pelleterade proverna lagras vid 4 °C på kort sikt (24 timmar).

5. Isopycnic densitetsgradientrening

OBS: Följande steg använder isopycnic densitetsgradientcentrifugering för att rena de råa mitokondriella och membranfraktionerna.

1. Bered en 50% (v / v) arbetslösning av jodoxanol genom att blanda 1 del spädningsvätska (beredd i steg 1.1.3) till 5 delar jodixanol (60% stamlösning (w / v)). Bered 10%, 15%, 20%, 25%, 30% och 35% jodoxanollösningar (v / v) genom att blanda 50% arbetslösning (v / v) med lysbuffert B i lämpliga kvantiteter.
2. Återsuspendera råa mitokondriella pellets och membranpellets (från steg 4.4 och 4.5) vardera i 200 μl lysbuffert B. Justera till 45 % jodoxanol (v/v) genom att tillsätta 1800 μl arbetsjodoxanollösning (50 % (v/v)) till 200 μl av den återsuspenderade pelleten.
3. Skapa en iodixanol diskontinuerlig gradient enligt följande (justera volymerna efter behov för ultracentrifugrörets kapacitet): Tillsätt 1 ml 15% jodoxanol (v / v) till botten av ett 8 ml, öppet, tunnväggigt ultracentrifugrör, placera 1 ml 20% jodixanol (v / v) under det första lagret (med underlagstekniken), följt av underlagring 1 ml 25% % 1 ml 30% och 1 ml 35% jodoxanol (v / v).
   OBS: Det bör skapas 2 gradienter i detta steg, 1 för mitokondriell fraktion och 1 för membranfraktionen.
4. I 1 lutning, tillsätt 2 ml av den råa mitokondriella pelleten (upphängd i 45% jodixanol (v / v)) med hjälp av underlagstekniken till botten av röret under 35% jodixanol (v / v). I den andra gradienten tillsätt 2 ml råmembranpellet (suspenderat i 45 % jodoxanol (v/v)) med hjälp av underlagstekniken till botten av röret under 35 % jodoxanol (v/v).
5. Tillsätt 1 ml 10% jodoxanol (v / v) till toppen av varje gradientrör genom att lägga över det ovanpå 15% -skiktet. Balansera rören inom 0,1 g från varandra genom tillsats av 10% jodoxanol (v/v).
6. Snurra densitetsgradientrören vid 4 °C i 18 timmar vid 100 000 × g. Var noga med att ställa in acceleration och retardation till minimivärdena för ultracentrifugen som används.
   OBS: I mitokondriell gradient kommer det att finnas ett synligt band vid gränssnittet mellan 25% och 30% jodixanol (v / v). Detta är den rena mitokondriella fraktionen. I membrangradienten kommer det att finnas ett synligt band i 15% jodixanol (v / v) fraktionen. Detta är den rena membranfraktionen. Det kan finnas ytterligare band i 25% och 30% jodixanol (v / v) fraktioner i membrangradienten. Detta är mitokondriell förorening.
7. Samla fraktioner från toppen av röret i 1 ml alikvoter, var noga med att minimera volymen av fraktionen som innehåller de synliga banden och byt pipettspetsen efter att varje lager har samlats in. Alternativt kan du punktera sidan av det tunnväggiga röret med en nål och samla de synliga banden.
8. Förvara proverna enligt beskrivningen i steg 2.8 tills de har kontrollerats med proteinanalys och western blot.

6. Isolering av kärnprotein

OBS: Med hjälp av joniska och icke-joniska tvättmedel samt tekniker som ultraljudsbehandling och centrifugering kommer följande steg att solubilisera alla cellulära membran och möjliggöra isolering av kärnproteiner.

1. Centrifugera 7,5 ml alikvot av celler suspenderade i lysbuffert A (från steg 2.4) och kassera supernatanten. Tillsätt 800 μl iskall CS-buffert (beredd i steg 1.2.4) och återsuspendera pelleten genom pipettering och virvelbildning. Inkubera proverna på is (eller vid 4 °C) i 30 minuter för att störa plasma- och organellmembranen samtidigt som kärnproteinerna skyddas.
2. Centrifugera cellsuspensionen vid 7 000 × g i 10 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Tillsätt 800 μl iskall NL-buffert (beredd i steg 1.2.5) till kärnpelleten efter införande av 1U/μl bensonas. Återsuspendera pelleten genom att försiktigt pipettera. Inkubera på en end-over-end-rotator i 30 minuter vid 4 °C för att störa kärnmembranet.
3. Sonicate för 5 s vid 20% effekt med provrör kylda i ett isbad (3x, med 5 s pauser mellan pulser), som tillsammans med bensonas (tillsatt i steg 6.2), kommer att skjuva nukleinsyrorna.
4. Centrifugera sonikatet vid 7 800 × g i 10 minuter vid 4 °C. Samla och spara supernatanten, som är kärnfraktionen. Var noga med att inte störa den olösliga pelleten medan du samlar supernatanten. För förvaring kan prover beredas enligt beskrivningen i steg 2.8.

7. Proteinkvantifiering och analys av western blot

OBS: Följande steg kommer att kvantifiera totalt protein i varje fraktion och bekräfta renheten hos de subcellulära fraktionerna.

1. Utför en standard Bradford-analys för att kvantifiera totalt protein i varje fraktion. Se tabell 1 för förväntade proteinutbyten.
   OBS: Andra proteinanalyser såsom bicinchoninic acid (BCA) -analys eller absorbans vid 280 nm kan användas för att mäta totalt protein i stället för en Bradford-analys.
2. Kombinera fraktioner med 1x Laemmli buffert innehållande 1x reduktionsmedel och värm vid 95 °C i 7 min. Ladda 10 μg av varje fraktion i en standard SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) gel och kör gelén vid 20 mA i 1 timme.
3. Överför de upplösta proteinerna till ett polyvinyldifluorid (PVDF) membran genom att utföra en standard immunoblotöverföring vid 100 V i 30 minuter. Blockera PVDF-membranet med 5% mjölk i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) som innehåller 0,1% av ett icke-joniskt tvättmedel (v / v) i 30 minuter vid rumstemperatur.
4. Tillsätt lämpliga primära antikroppar för att detektera hushållningsproteiner som är specifika för varje subcellulär fraktion och inkubera över natten vid 4 °C. Tvätta membranet med 5% mjölk i 1x TBS innehållande 0,1% av det icke-joniska tvättmedlet (v/v) i 10 min vid rumstemperatur.
   OBS: För detta protokoll användes antikroppar mot glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH, 1: 10000), histon H3 (1: 2000), spänningsberoende anjonkanal (VDAC, 1: 1000) och Na, K ⁺ -ATPas för cytosoliska, nukleära, mitokondriella respektive membranfraktioner.
5. Tillsätt lämpliga pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerade sekundära antikroppar till membranet (späd enligt tillverkarens anvisningar) och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme. Tvätta membranet med 5% mjölk i 1x TBS innehållande 0,1% av det icke-joniska tvättmedlet (v/v) i 10 min vid rumstemperatur. Utveckla fläcken med standard kemiluminescens.

Representative Results

Ett schematiskt flödesschema för denna procedur (figur 1) sammanfattar visuellt de steg som togs för att framgångsrikt fraktionera U937^5-celler som odlas i suspension. Fraktioner uppsamlade från toppen av den isopykniska densitetsgradienten i lika stora volymer (1 ml) visar reningen av mitokondriella och membranfraktioner (figur 2). Genom att använda en antikropp mot VDAC, ett protein lokaliserat till det yttre mitokondriella membranet⁶, visar att mitokondriell fraktion migrerade till 25% och 30% jodoxanol (v / v) fraktioner (Figur 2A). Med hjälp av en antikropp mot underenheten Na,K⁺-ATPas α1, en del av en integrerad membranheterodimer som främst finns i plasmamembranet⁷, visas separationen av membrankontaminering från den rena mitokondriella fraktionen (figur 2A). Den rena membranfraktionen migrerade till de minst täta fraktionerna, 10% och 15% jodoxanol (v / v) (figur 2B). Mitokondriell kontaminering av membranfraktionen separerades av gradienten.

En western blot⁸ som utförs med de ytterligare lokaliseringsmarkörerna (refereras till i steg 7.4) visar renheten hos de cytosoliska och nukleära fraktionerna, samtidigt som det dessutom verifieras att mitokondriella prover och membranprover är fria från kontaminering av proteiner från andra delar av cellen (figur 3). Användning av en antikropp mot GAPDH, normalt lokaliserad till cytoplasman i cellen⁹, visar att detta protein endast finns i den cytosoliska fraktionen (figur 3A, lane 1, första panelen) och att ingen förorening observeras i de extraherade kärnproteinerna, de densitetsrenade mitokondrierna eller membranfraktionerna (figur 3A; Körfält 2, 3 och 4; första panelen). Probing för histon H3, ett protein som finns i kärnan och är involverat i kromatinstruktur¹⁰, visar en framgångsrik kärnextraktion (figur 3A, lane 2, andra panelen), med viss minimal detektion i den cytoplasmatiska fraktionen och ingen korskontaminering i mitokondriella eller membranfraktioner.

Sondering för VDAC i alla fraktioner visar närvaron av detta protein i den rena mitokondriella fraktionen (figur 3A, körfält 3, tredje panelen) och att ingen korskontaminering existerar i de andra fraktionerna (figur 3A; Körfält 1, 2 och 4; tredje panelen). Sondering för Na/K-ATPas α1-underenheten visar på liknande sätt att detta protein endast är beläget i den rena membranfraktionen (figur 3A, körfält 4, fjärde panelen). Dessa fraktioner analyserades med densitometri för att bekräfta reproducerbarhet och statistisk signifikans (figur 3B-E). I motsats till resultaten från den framgångsrika fraktioneringen (figur 3) kan felaktigt utförande av denna metod (eller underlåtenhet att följa alla rekommenderade steg) resultera i korskontaminering av cellulära komponenter (figur 4). En hög koncentration av histon H3 i den cytosoliska fraktionen (figur 4, körfält 1, andra panelen) kan bero på att cytosolfraktionen inte klargörs ordentligt (refereras i steg 2.6). Detta kan inträffa om inte tillräckligt med förtydligande centrifugspinn utförs, eller om den cytosoliska fraktionen inte klargörs snabbt. Om den cytosoliska fraktionen inte klargörs tillräckligt snabbt kan det leda till lys av cellfragment, vilket leder till kontaminering av den cytosoliska fraktionen.

Underlåtenhet att utföra det isopycniska densitetsreningssteget kommer att resultera i förorening av membranfraktionen (figur 4, körfält 4, alla paneler), beroende på hur heterogent provet är före densitetsrening. Korrekt efterlevnad av alla steg i protokollet är avgörande för att erhålla önskad separation av de subcellulära fraktionerna. När det kvantifieras med hjälp av en Bradford-analys kan proteinutbytet för varje fraktion bestämmas. Förväntat proteinutbyte per fraktion redovisas i tabell 1. Det är användbart att utföra en proteinkvantifieringsanalys innan du utför western blots av flera skäl. För det första bekräftar det att fraktioner verkligen innehåller protein; för det andra tillåter det laddning av SDS-PAGE-geler baserat på proteinkvantitet; och slutligen, förutsatt att proteinutbytet liknar det förväntade (tabell 1), bekräftar det korrekt genomförande av förfarandet.

Figur 1: Diagram över cellfraktioneringsproceduren. En översikt över cellfraktioneringsprotokollet som representeras som ett flödesschema. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; CS = celllöslighet; NL = kärnlys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Isopycnic densitetsrening av råa mitokondriella och membranfraktioner . (A) Representativ västlig fläck av alla fraktioner som samlats in efter densitetsgradientrening av den råa mitokondriella fraktionen. (B) Representativ western blot för alla fraktioner som samlats in efter densitetsgradientrening av råmembranfraktionen. Båda densitetsgradientreningarna visar migration av mitokondriell markör, VDAC, för 25% och 30% jodixanol (v / v) fraktioner och migration av membranmarkören, Na, K ⁺ ATPas, för 10% och 15% jodixanol (v / v) fraktioner. Förkortning: VDAC = spänningsberoende anjonkanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Framgångsrik isolering av U937 cytosoliska, nukleära, mitokondriella och membranfraktioner. (A) Representativa västra fläckar av cellfraktioner isolerade från en U937-cellodling med denna teknik och sonderade för markörer för cytoplasma (GAPDH, första panelen), kärnan (Histone H3, andra panelen), mitokondrier (VDAC, tredje panelen) och membran (Na, K ⁺ ATPas α1, fjärde panelen). (B–E) Densitometri av västerländska blottar av cellfraktioner isolerade från U937-cellkulturer med denna teknik. Resultaten är från 3 oberoende experiment. Felstaplar representerar standardavvikelse. Enkelriktad ANOVA. s<0.001. Förkortningar: GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas; VDAC = spänningsberoende anjonkanal; cyto = cytosolisk; nuc = kärnkraft; mito = mitokondriell; mem = membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Ofullständig fraktionering av U937-cellkomponenter. Representativa västra fläckar av cellfraktioner isolerade från en U937-cellodling som visar kontaminering av den cytosoliska fraktionen med histon H3 (Lane 1, andra panelen) på grund av felaktig förtydligande av denna fraktion och en rå membranfraktion som inte utsattes för isopycnic density gradient reification (Lane 4, alla paneler). Förkortningar: cyto = cytosolisk; nuc = kärnkraft; mito = mitokondriell; mem = membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bråk	Utbyte (μg/ml)	Standardavvikelse	Ungefärlig volym
Cytoplasman	1500	146	5 ml
Kärna	1200	172	500 μl
Mitokondrier	400	66	500 μl
Membran	200	23	500 μl

Tabell 1: Proteinutbyte för varje subcellulär fraktion.

Discussion

Denna metod är en modifierad version av ett tidigare publicerat tillvägagångssätt för subcellulär fraktionering utan användning av höghastighetscentrifugering¹¹. Denna modifierade metod kräver mer specialutrustning för att uppnå bästa resultat, men är mer omfattande och konsekvent reproducerbar.

Utvecklingen av det ursprungliga protokollet var nödvändigt på grund av en oförmåga att separera mitokondriella och membranprover för analys av proteinlokalisering under nekroptos¹². Försök att använda de uteslutande tvättmedelsbaserade metoder som finns i de flesta kommersiellt tillgängliga kit resulterade i en homogen blandning innehållande plasmamembranet och alla membranslutna organeller i cellen. Andra begränsningar av dessa kit inkluderar en oförmåga att göra ändringar i proceduren, kostnad per prov, volymbegränsningar och antal prover som kan bearbetas. Förfarandet som presenteras här kan ändras till vilken skala som helst, ändras för att isolera färre fraktioner och kan utföras utan användning av dyra reagenser. Fraktionsutbyten kan ökas genom att använda fler celler; stegen kan skräddarsys för den forskning som utförs, och utförandet av metoden är flexibelt. Till exempel, om forskare inte undersöker en viss subcellulär fraktion, behöver de inte isolera det provet under procedurens gång. På samma sätt kan tillsatsen av särskilda hämmare eller reagenser utelämnas om forskaren inte planerar att studera fosforyleringstillståndet för proteiner (natriumortovanadat) eller inte är orolig för denaturerande proteiner (hexylenglykol).

Användningen av jodoxanol som densitetsgradientlösning är valfri; Detta reagens stör dock inte efterföljande undersökning av prover via Western Blotting. Det är också möjligt att avlägsna jodaxanol från prover genom utspädning och centrifugering för att återvinna mitokondrierna eller membranet, även om detta kommer att påverka det slutliga utbytet. Andra alternativa densitetsgradientlösningar kan användas, inklusive sackaros. För att få optimala resultat och rena fraktioner finns det flera faktorer att tänka på, och särskilda kritiska steg i protokollet som kräver noggrann uppmärksamhet. Detta protokoll är optimerat för fraktionering av U937-celler, och koncentrationen av celler som rekommenderas vid vissa punkter i protokollet är specifika för denna cellinje. Dessa värden bestämdes empiriskt och kommer sannolikt att behöva justeras för olika typer av celler, särskilt om suboptimala resultat erhålls vid utförandet av protokollet.

Förtydligande av det cytoplasmatiska provet bör ske så snart som möjligt för att avlägsna obrutna celler och skräp som kan leda till korskontaminering av proteiner från andra subcellulära fraktioner (figur 4, körfält 1, andra panelen). Homogenisering kan åstadkommas med någon form av mekanisk lys, även om resultaten som presenteras här erhölls med användning av en pärlbaserad metod och mixeranordning. Alternativa manuella former av homogenisering (en Dounce-homogenisator eller passage genom en liten mätnål) kan också användas, men kan leda till reproducerbarhetsproblem på grund av teknikens variation av individen som utför proceduren. Denna grupps intresse är främst i cirkulerande leukocyter, varför U937-celler används i denna procedur. Detta förfarande kan dock tillämpas på andra suspensionscellinjer med sannolikt litet behov av förändring. Delar som kan behöva justeras för att rymma en annan suspensionscellinje inkluderar cellkoncentrationer som används under hela proceduren samt koncentrationen av digitonin som används för att extrahera den cytosoliska fraktionen.

Även om den inte är optimerad för vidhäftande cellinjer, kan denna procedur fungera som en utgångspunkt för att justeringar kan göras för att rymma vidhäftande celler. Dessa justeringar inkluderar cellkoncentration, koncentration av digitonin och homogeniseringstid. Dessutom begränsas vidhäftande celler av ytarea medan suspensionsceller begränsas av volym; Detta gör uppskalning av suspensionsceller enklare. För att skala upp vidhäftande celler måste vävnadsodlingsplattor med stor yta (>500 cm²) användas. Denna procedur är en kostnadseffektiv, reproducerbar subcellulär fraktionering med förmågan att separera cytosoliska, nukleära, mitokondriella och membranfraktioner med stor renhet. En av de största fördelarna med denna procedur är separationen av mitokondriell från membranfraktionen. Detta är inte möjligt i uteslutande tvättmedelsbaserade förfaranden. Även om tvättmedel används i denna procedur används de för att permeabilisera, men inte störa plasmamembranet (digitonin) och för att erhålla kärnfraktionen efter isolering av mitokondriella och membranfraktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661