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Biochemistry

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung subzellulärer Proteinfraktionen aus Säugetierzellen unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien, mechanischer Lyse und isopyknischer Dichtegradientenzentrifugation. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht auf die alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien angewiesen ist, um subzelluläre Fraktionen zu erhalten. Dadurch ist es möglich, die Plasmamembran von anderen membrangebundenen Organellen der Zelle zu trennen. Dieses Verfahren wird die Bestimmung der Proteinlokalisation in Zellen mit einer reproduzierbaren, skalierbaren und selektiven Methode erleichtern. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um zytosolische, nukleare, mitochondriale und Plasmamembranproteine aus der menschlichen Monozytenzelllinie U937 zu isolieren. Obwohl für diese Zelllinie optimiert, kann dieses Verfahren als geeigneter Ausgangspunkt für die subzelluläre Fraktionierung anderer Zelllinien dienen. Mögliche Fallstricke des Verfahrens und wie diese vermieden werden können, werden ebenso diskutiert wie Veränderungen, die möglicherweise für andere Zelllinien berücksichtigt werden müssen.

Introduction

Subzelluläre Fraktionierung ist ein Verfahren, bei dem Zellen lysiert und durch verschiedene Methoden in ihre Bestandteile getrennt werden. Diese Technik kann von Forschern verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in Säugetierzellen zu bestimmen oder Proteine mit geringer Abundanz anzureichern, die sonst nicht nachweisbar wären. Während es derzeit Methoden zur subzellulären Fraktionierung gibt, ebenso wie kommerzielle Kits, die erworben werden können, leiden sie unter mehreren Einschränkungen, die dieses Verfahren zu überwinden versucht. Die meisten Zellfraktionierungsmethoden basieren ausschließlich auf Detergenzien1,2 und basieren auf der Verwendung von Puffern, die zunehmende Mengen an Detergens enthalten, um verschiedene zelluläre Komponenten zu lösen. Während diese Methode schnell und bequem ist, führt sie zu unreinen Fraktionen. Diese sind so konzipiert, dass Forscher eine oder zwei Komponenten der Zelle leicht isolieren können, sind aber nicht komplex genug, um mehrere subzelluläre Fraktionen gleichzeitig aus einer Probe zu isolieren. Sich ausschließlich auf Reinigungsmittel zu verlassen, führt in der Regel dazu, dass membranumschlossene Organellen und die Plasmamembran wahllos gelöst werden, was die Trennung dieser Komponenten erschwert. Eine zusätzliche Komplikation durch die Verwendung dieser Kits ist die Unfähigkeit der Forscher, sie für bestimmte Anwendungen zu ändern / zu optimieren, da die meisten Komponenten proprietäre Formulierungen sind. Schließlich können diese Kits unerschwinglich teuer sein, mit Einschränkungen in der Anzahl der Anwendungen, die sie für größere Proben nicht ideal machen.

Trotz der Verfügbarkeit von Kits für die Isolierung von Mitochondrien, die nicht auf Detergenzien angewiesen sind, sind sie nicht für die Isolierung der Plasmamembran ausgelegt und liefern signifikant geringere Probenmengen als Standard-Isolierungsprotokolle 3,4. Während differentielle Zentrifugationsmethoden zeitaufwendiger sind, führen sie oft zu unterschiedlichen Fraktionen, die mit ausschließlich waschmittelbasierten Kits nicht erhalten werden können1. Die Trennung ohne alleinige Verwendung von Solubilisierungsdetergenzien ermöglicht auch eine weitere Reinigung mittels Ultrazentrifugation und isopyknischen Dichtegradienten, was zu weniger Kreuzkontamination führt. Dieses Fraktionierungsprotokoll demonstriert die Isolierung subzellulärer Fraktionen aus U937-Monozyten unter Verwendung einer Kombination aus Detergenzien- und Hochgeschwindigkeitszentrifugationsansätzen. Diese Methode erleichtert die Isolierung der Kern-, Zytoplasma-, Mitochondrien- und Plasmamembrankomponenten einer Säugetierzelle mit minimaler Kontamination zwischen den Fraktionen.

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Protocol

1. Puffer und Reagenzien vorbereiten

  1. Bereiten Sie frische Lösungen von Phosphatase- und Proteaseinhibitoren vor.
    1. 17,4 mg Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zu 1 ml 100% Ethanol hinzufügen, um eine 100 mM Brühe herzustellen.
      HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung beim Umgang mit PMSF, da diese bei Einnahme oder Einatmen und bei Kontakt mit Haut oder Augen gefährlich ist. Es ist ätzend für Augen und Haut.
    2. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen handelsüblichen Proteaseinhibitor-Cocktail (100x) vor.
    3. Fügen Sie 91,9 mg Natriumorthovanadat (SOV) zu 1 ml entionisiertem Wasser hinzu, um eine 500 mM Brühe herzustellen.
      HINWEIS: Tragen Sie Schutzausrüstung, wenn Sie mit SOV umgehen, da es gefährlich ist, wenn es verschluckt, eingeatmet oder bei Kontakt mit den Augen ist. Eine starke Überbelichtung kann zum Tod führen.
  2. Bereiten Sie den Lysepuffer A, den zytoplasmatischen Isolierungspuffer (CI), den Zellsolubilisierungspuffer (CS), den Kernlysepuffer (NL), den Lysepuffer B, den Zellhomogenisierungspuffer (CH), das Iodixanolverdünnungsmittel und die Reinigungsmittel vor.
    1. 8,7 g Natriumchlorid (NaCl) und 50 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES, 1 M, pH 7,4) zu 950 ml entionisiertem Wasser zugeben, um Lysepuffer A herzustellen (Endkonzentrationen von 150 mM NaCl und 50 mM HEPES).
    2. Stammlösungen von Detergenzien werden wie folgt hergestellt: 0,1 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 1% SDS) hinzufügen, 0,1 g Natriumdesoxycholat zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 1%) hinzufügen, 2,5 mg Digitonin zu 10 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 250 μg/ml) hinzufügen, und 1 ml nichtionisches, nicht denaturierendes Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle) zu 9 ml Lysepuffer A (Endkonzentration von 10 % (v/v)) hinzufügen.
    3. Bereiten Sie den CI-Puffer vor, indem Sie 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Bestand (500 mM) und 100 μL Standarddigitonin (250 μg/ml) zu 878 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV und 25 μg/ml Digitonin) hinzufügen. Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
    4. CS-Puffer vorbereiten, indem 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Vorrat (500 mM), 100 μL nichtionisches, nicht denaturierendes Waschmittelmaterial (siehe Materialtabelle) (10%) und 118 μL Hexylenglykolvorrat (8,44 M) zu 760 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV, 1% nichtionisches, nicht denaturierendes Reinigungsmittel und 1 M Hexylenglykol). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
    5. NL-Puffer werden durch Zugabe von 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM), 10 μL Proteaseinhibitor (100x), 2 μL SOV-Bestand (500 mM), 50 μL Natriumdesoxycholat-Brühe (10%), 100 μL SDS-Brühe (1%) und 118 μL Hexylenglykol-Brühe (8,44 M) zu 710 μL Lysepuffer A (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitor, 1 mM SOV, 0,5% Natriumdesoxycholat (v/v), 0,1% SDS (w/v) und 1 M Hexylenglykol). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Kernpellet hinzugefügt wird.
    6. 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g Kaliumchlorid (KCl), 0,19 g Magnesiumchlorid (MgCl2), 2 ml Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 M EDTA), 2 ml Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (0,5 M EGTA), 38,3 g Mannit und 23,9 g Saccharose zu 980 ml entionisiertem Wasser zugeben, um den Lysepuffer B (Endkonzentrationen von 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mMMgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM Mannit und 70 mM Saccharose).
    7. Bereiten Sie den CH-Puffer vor, indem Sie 10 μL PMSF-Vorrat (100 mM) und 2 μL SOV-Vorrat (500 mM) zu 988 μL Lysepuffer B (Endkonzentrationen von 1 mM PMSF und 1 mM SOV) hinzufügen; passen Sie das Endvolumen an die Anzahl der zu lysierenden Zellen an). Halten Sie die Lösung auf Eis, bis sie zum Zellpellet hinzugefügt wird.
    8. Iodixanolverdünnungsmittel werden durch Zugabe von 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 gMgCl2, 1,2 ml 0,5 M EDTA, 1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g Mannit und 14,4 g Saccharose zu 88 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentrationen von 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM Mannit und 420 mM Saccharose).
    9. Lagerpuffer bei 4 °C und Digitonin bei -20 °C.

2. Zytosolische Proteinisolierung

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen das Wachstum und die Expansion von U937-Zellen, gefolgt von der Extraktion zytosolischer Proteine. Bei der verwendeten Konzentration permeabilisiert Diironin die Plasmamembran, ohne sie zu stören, was die Freisetzung zytosolischer Proteine und die Retention anderer zellulärer Proteine ermöglicht.

  1. Kultur der Zellen in RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum bei 37 °C und 5%CO2. Stellen Sie sicher, dass die Zellen auf eine Endsumme von 6 x 108 Zellen gezüchtet werden.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurden die Zellen mit einem Standard-Hämozytometer und Mikroskop gezählt.
  2. Zentrifugieren Sie die kultivierten Zellen bei 400 × g für 10 min. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur in einer Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/ml resuspendiert und vorsichtig pipettiert, um Klumpen aufzubrechen.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 × g für 10 min, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in eiskaltem Lysepuffer A (hergestellt in Schritt 1.2.1) in einer Endkonzentration von 2 × 107 Zellen/ml resuspendiert.
  4. Entfernen Sie 7,5 ml der im Lysepuffer A suspendierten Zellen (3 × 107 Zellen) und halten Sie sie auf Eis für die Kernproteinextraktion (Abschnitt 6). Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C, 400 × g für 10 min, um die Zellen zu pelletieren.
    HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte bei 4 °C oder auf Eis durch und kühlen Sie alle Puffer vor.
  5. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in CI-Puffer in einer Endkonzentration von 2 × 107 Zellen / ml und pipetten Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen. Drehen Sie die Zellsuspension 20 min lang bei 4 °C.
  6. Die Zellsuspension wird bei 4 °C, 400 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt. Speichern Sie das Zellpellet und lagern Sie es auf Eis. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 4 °C, 18.000 × g für 20 min zu pelletierten Zelltrümmern.
    HINWEIS: Dieser Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritt ist entscheidend, um eine Kontamination der zytosolischen Fraktion mit Organellen und membrangebundenen Proteinen zu verhindern.
  7. Entsorgen Sie das Pellet, nachdem Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt haben. Wiederholen Sie beide Zentrifugationsschritte in Schritt 2.6, bis nach der Zentrifugation kein Pellet mehr erhalten wird.
  8. Sammeln Sie den Überstand, der die zytosolische Fraktion ist. Bei kurzfristiger Lagerung (1 Monat) ist darauf zu achten, dass der Überstand bei 4 °C gelagert wird. Für die Langzeitlagerung (>1 Monat) den Überstand mit 1x Laemmli-Puffer mit 1x Reduktionsmittel vermischen, 7 min bei 95 °C erhitzen und bei -20 oder -80°C lagern.
  9. Resuspendieren Sie das Zellpellet (aus Schritt 2.6) in Lysepuffer A bei einer Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/ml; Pipetten Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen.

3. Zellhomogenisierung

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen die mechanische Homogenisierung von digitoninbehandelten Zellen (ab Schritt 2.9), die für die Isolierung der mitochondrialen und Membranproteinfraktionen erforderlich ist.

  1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension im Lysepuffer A (vorbereitet in Schritt 2.9), speichern Sie das Pellet und verwerfen Sie den Überstand, um überschüssiges Digitonin und zytosolische Verunreinigungen aus dem Zellpellet zu entfernen.
    HINWEIS: Wiederholte Waschungen im Lysepuffer A können durchgeführt werden, um überschüssige zytosolische Verunreinigungen zu entfernen.
  2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem CH-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.7) in einer Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/ml. Die Zellsuspension 30 min auf Eis inkubieren.
  3. Wenn Sie ein perlenbasiertes Verfahren für die mechanische Lyse verwenden, geben Sie 30 g vorgewaschene 3,2-mm-Edelstahlperlen in ein 50-ml-Sockelrohr, füllen Sie es mit 15 ml Lysepuffer B und legen Sie es zum Abkühlen auf Eis. Wenn Sie einen Dounce-Homogenisator (mit einem eng anliegenden B-Stößel) verwenden, füllen Sie ihn mit einem geeigneten Volumen Lysepuffer B, setzen Sie den Stößel ein und legen Sie ihn zum Abkühlen auf Eis.
  4. Nach der Inkubation (Schritt 3.2) wird der Lysepuffer B aus den Bead-Röhrchen (oder dem Dounce-Homogenisator) verworfen und 15 ml der Zellsuspension in das Bead-Röhrchen (oder ein geeignetes Volumen in den Homogenisator) überführt.
  5. Wenn Sie die perlenbasierte Methode verwenden, legen Sie die gesäumten Perlenröhrchen mit der Zellsuspension in die Mischvorrichtung und konfigurieren Sie sie so, dass sie 5 Minuten lang bei Geschwindigkeit 8 laufen. Wenn Sie einen Dounce-Homogenisator verwenden, halten Sie ihn auf Eis und führen Sie 40 Durchgänge mit dem Stößel mit langsamen, gleichmäßigen Schlägen durch (oder verwenden Sie eine alternative Methode der mechanischen Zelllyse, wie im Diskussionsabschnitt beschrieben).
    HINWEIS: Wenn Sie ein anderes als das hier verwendete Mischgerät verwenden, müssen Geschwindigkeit und Zeit möglicherweise empirisch bestimmt werden.
  6. Das Homogenat in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und speichern; Entsorgen Sie das Pellet.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und das Homogenat kurzfristig (24 h) bei 4 °C gelagert werden.

4. Entfernung von Trümmern und Isolierung von rohen mitochondrialen und Membranfraktionen

HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen die Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugieren des Homogenats mit zunehmender Geschwindigkeit. Es folgt eine Differentialzentrifugation zur Isolierung von rohen mitochondrialen und Membranfraktionen.

  1. Das Homogenat (ab Schritt 3.6) wird bei 500 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
  2. Zentrifugieren Sie den Überstand (aus Schritt 4.1) bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
  3. Zentrifugieren Sie den Überstand (aus Schritt 4.2) bei 2.000 × g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen geben und das Pellet entsorgen.
  4. Zentrifugieren Sie den Überstand (ab Schritt 4.3) bei 4.000 × g für 20 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und speichern Sie das Pellet, das die rohe mitochondriale Fraktion ist.
  5. Zentrifugieren des Überstands (ab Schritt 4.4) bei 18.000 × g für 1 h bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und speichern Sie das Pellet, das die rohe Membranfraktion ist.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und die pelletierten Proben kurzfristig (24 h) bei 4 °C gelagert werden.

5. Isopyknische Dichtegradientenreinigung

HINWEIS: Die folgenden Schritte verwenden eine isopyknische Dichtegradientenzentrifugation, um die rohen mitochondrialen und Membranfraktionen zu reinigen.

  1. Herstellen einer 50%igen (v/v) Arbeitslösung von Jodixanol durch Mischen von 1 Teil Verdünnungsmittel (hergestellt in Schritt 1.1.3) zu 5 Teilen Jodixanol (60%ige Stammlösung (w/v)). Bereiten Sie 10%, 15%, 20%, 25%, 30% und 35% Iodixanollösungen (v/v) durch Mischen von 50% Arbeitslösung (v/v) mit Lysepuffer B in geeigneten Mengen her.
  2. Die rohen mitochondrialen und Membranpellets (aus den Schritten 4.4 und 4.5) werden jeweils in 200 μL Lysepuffer B resuspendiert. Auf 45% Iodixanol (v/v) durch Zugabe von 1800 μL Iodixanollösung (50% (v/v)) zu 200 μL des resuspendierten Pellets eingestellt.
  3. Erstellen Sie einen diskontinuierlichen Iodixanol-Gradienten wie folgt (passen Sie die Volumina entsprechend der Kapazität des Ultrazentrifugenröhrchens an): Fügen Sie 1 ml 15% Jodixanol (v / v) auf den Boden eines 8 ml, offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens hinzu, legen Sie 1 ml 20% Jodixanol (v / v) unter die erste Schicht (durch die Unterlagetechnik), gefolgt von der Unterlagerung von 1 ml von 25%, 1 ml von 30% und 1 ml von 35% Jodixanol (v / v).
    HINWEIS: Bei diesem Schritt sollten 2 Gradienten erzeugt werden, 1 für die mitochondriale Fraktion und 1 für die Membranfraktion.
  4. In 1 Gradient fügen Sie die 2 ml des rohen mitochondrialen Pellets (suspendiert in 45% Jodixanol (v / v)) unter Verwendung der Underlay-Technik auf den Boden des Röhrchens unter dem 35% Iodixanol (v / v) hinzu. Im anderen Gradienten fügen Sie die 2 ml des rohen Membranpellets (suspendiert in 45% Iodixanol (v / v)) unter Verwendung der Unterlagstechnik auf den Boden des Röhrchens unterhalb des 35% Jodixanols (v / v) hinzu.
  5. Fügen Sie 1 ml 10% Iodixanol (v / v) zur Oberseite jedes Gradientenrohrs hinzu, indem Sie es über die 15% ige Schicht legen. Balancieren Sie die Röhrchen innerhalb von 0,1 g voneinander durch Zugabe von 10% Jodixanol (v / v).
  6. Schleudern Sie die Dichtegradientenrohre bei 4 °C für 18 h bei 100.000 × g. Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung auf die Mindestwerte für die verwendete Ultrazentrifuge ein.
    HINWEIS: Im mitochondrialen Gradienten wird es eine sichtbare Bande an der Grenzfläche zwischen 25% und 30% Iodixanol (v / v) geben. Dies ist die reine mitochondriale Fraktion. Im Membrangradienten befindet sich eine sichtbare Bande in der 15% Iodixanol (v/v) Fraktion. Dies ist die reine Membranfraktion. Es kann zusätzliche Banden in den 25% und 30% Iodixanol (v / v) -Fraktionen im Membrangradienten geben. Dies ist mitochondriale Kontamination.
  7. Sammeln Sie Fraktionen von der Oberseite des Röhrchens in 1 ml Aliquots, achten Sie darauf, das Volumen der Fraktion, die die sichtbaren Bänder enthält, zu minimieren und die Pipettenspitze zu wechseln, nachdem jede Schicht gesammelt wurde. Alternativ können Sie die Seite des dünnwandigen Rohrs mit einer Nadel durchstechen und die sichtbaren Bänder sammeln.
  8. Lagern Sie die Proben wie in Schritt 2.8 beschrieben, bis zur Überprüfung durch Proteintest und Western Blot.

6. Isolierung von Kernproteinen

HINWEIS: Mit ionischen und nichtionischen Reinigungsmitteln sowie Techniken wie Ultraschall und Zentrifugation werden die folgenden Schritte alle Zellmembranen auflösen und die Isolierung von Kernproteinen ermöglichen.

  1. Zentrifugieren Sie das 7,5-ml-Aliquot von Zellen, die im Lysepuffer A suspendiert sind (aus Schritt 2.4), und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 800 μL eiskalten CS-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.4) hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren und Wirbeln. Inkubieren Sie die Proben auf Eis (oder bei 4 °C) für 30 Minuten, um das Plasma und die Organellenmembranen zu stören und gleichzeitig die Kernproteine zu schützen.
  2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 7.000 × g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie den Überstand. Nach Zugabe von 1U/μL Benzonase werden dem Kernpellet 800 μL eiskalter NL-Puffer (hergestellt in Schritt 1.2.5) zugegeben. Resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren. Inkubieren Sie auf einem End-over-End-Rotator für 30 min bei 4 °C, um die Kernmembran zu stören.
  3. 5 s bei 20% Leistung mit Probenröhrchen in einem Eisbad abgekühlt (3x, mit 5 s Pausen zwischen den Impulsen), die zusammen mit Benzonase (in Schritt 6.2 hinzugefügt) die Nukleinsäuren scheren.
  4. Zentrifugieren Sie das Schall bei 7.800 × g für 10 min bei 4 °C. Sammle und rette den Überstand, der die Kernfraktion ist. Achten Sie darauf, das unlösliche Pellet nicht zu stören, während Sie den Überstand sammeln. Für die Lagerung können Proben wie in Schritt 2.8 beschrieben vorbereitet werden.

7. Proteinquantifizierung und Western-Blot-Analyse

HINWEIS: Die folgenden Schritte quantifizieren das Gesamtprotein in jeder Fraktion und bestätigen die Reinheit der subzellulären Fraktionen.

  1. Führen Sie einen Standard-Bradford-Test durch, um das Gesamtprotein in jeder Fraktion zu quantifizieren. Die erwarteten Proteinerträge finden Sie in Tabelle 1 .
    HINWEIS: Andere Proteinassays wie der Bicchininsäure-Assay (BCA) oder die Absorption bei 280 nm können anstelle eines Bradford-Assays zur Messung des Gesamtproteins verwendet werden.
  2. Fraktionen mit 1x Laemmli Puffer mit 1x Reduktionsmittel kombinieren und bei 95 °C 7 min erhitzen. Laden Sie 10 μg jeder Fraktion in ein Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (PAGE) und lassen Sie das Gel bei 20 mA für 1 h laufen.
  3. Die aufgelösten Proteine werden auf eine Polyvinyldifluorid (PVDF)-Membran übertragen, indem ein Standard-Immunoblot-Transfer bei 100 V für 30 min durchgeführt wird. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5% Milch in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 0,1% eines nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) enthält, für 30 min bei Raumtemperatur.
  4. Fügen Sie die entsprechenden primären Antikörper hinzu, um Haushaltsproteine nachzuweisen, die für jede subzelluläre Fraktion spezifisch sind, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Membran mit 5% Milch in 1x TBS mit 0,1% des nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) für 10 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden Antikörper gegen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, 1:10000), Histon H3 (1:2000), spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC, 1:1000) und Na,K+-ATPase für zytosolische, nukleare, mitochondriale und Membranfraktionen verwendet.
  5. Die entsprechenden Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper in die Membran geben (gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Membran mit 5% Milch in 1x TBS mit 0,1% des nichtionischen Reinigungsmittels (v/v) für 10 min bei Raumtemperatur. Entwickeln Sie den Blot mit Standard-Chemilumineszenz.

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Representative Results

Ein schematisches Flussdiagramm dieses Verfahrens (Abbildung 1) fasst visuell die Schritte zusammen, die unternommen wurden, um U9375-Zellen erfolgreich zu fraktionieren, die in Suspension gezüchtet wurden. Fraktionen, die von der Oberseite des isopyknischen Dichtegradienten in gleichen Volumina (1 ml) gesammelt wurden, zeigen die Reinigung der mitochondrialen und Membranfraktionen (Abbildung 2). Die Verwendung eines Antikörpers gegen VDAC, ein Protein, das in der äußeren Mitochondrienmembran6 lokalisiert ist, zeigt, dass die mitochondriale Fraktion zu den 25% und 30% Iodixanol (v / v) -Fraktionen migrierte (Abbildung 2A). Die Verwendung eines Antikörpers gegen die Na,K+-ATPase α1-Untereinheit, Teil eines integralen Membranheterodimers, das hauptsächlich in der Plasmamembran7 vorkommt, zeigt die Trennung der Membrankontamination von der reinen mitochondrialen Fraktion (Abbildung 2A). Die reine Membranfraktion wanderte zu den am wenigsten dichten Fraktionen, 10% und 15% Iodixanol (v/v) (Abbildung 2B). Die mitochondriale Kontamination der Membranfraktion wurde durch den Gradienten getrennt.

Ein Western Blot8, der mit den zusätzlichen Lokalisationsmarkern (siehe Schritt 7.4) durchgeführt wurde, zeigt die Reinheit der zytosolischen und nukleären Fraktionen und bestätigt zusätzlich, dass die mitochondrialen und Membranproben frei von Verunreinigungen durch Proteine aus anderen Teilen der Zelle sind (Abbildung 3). Die Verwendung eines Antikörpers gegen GAPDH, der normalerweise im Zytoplasma der Zelle9 lokalisiert ist, zeigt, dass dieses Protein nur in der zytosolischen Fraktion gefunden wird (Abbildung 3A, Bahn 1, erstes Panel) und dass keine Kontamination in den extrahierten Kernproteinen, den dichtegereinigten Mitochondrien oder Membranfraktionen beobachtet wird (Abbildung 3A; Bahnen 2, 3 und 4; erste Tafel). Die Untersuchung nach Histon H3, einem Protein, das im Zellkern gefunden wird und an der Chromatinstruktur10 beteiligt ist, zeigt eine erfolgreiche Kernextraktion (Abbildung 3A, Bahn 2, zweites Bild), mit einem minimalen Nachweis in der zytoplasmatischen Fraktion und keiner Kreuzkontamination in den mitochondrialen oder Membranfraktionen.

Die Untersuchung auf VDAC in allen Fraktionen zeigt das Vorhandensein dieses Proteins in der reinen mitochondrialen Fraktion (Abbildung 3A, Bahn 3, drittes Feld), und dass in den anderen Fraktionen keine Kreuzkontamination besteht (Abbildung 3A; Spur 1, 2 und 4; drittes Panel). Die Untersuchung der Na/K-ATPase α1-Untereinheit zeigt ebenfalls, dass sich dieses Protein nur in der reinen Membranfraktion befindet (Abbildung 3A, Bahn 4, viertes Bild). Diese Fraktionen wurden mittels Densitometrie analysiert, um Reproduzierbarkeit und statistische Signifikanz zu bestätigen (Abbildung 3B-E). Im Gegensatz zu den Ergebnissen der erfolgreichen Fraktionierung (Abbildung 3) kann eine unsachgemäße Ausführung dieser Methode (oder die Nichteinhaltung aller empfohlenen Schritte) zu einer Kreuzkontamination zellulärer Komponenten führen (Abbildung 4). Eine hohe Konzentration von Histon H3 in der zytosolischen Fraktion (Abbildung 4, Bahn 1, zweites Panel) kann daraus resultieren, dass die zytosolische Fraktion nicht richtig geklärt wurde (siehe Schritt 2.6). Dies kann auftreten, wenn nicht genügend Klärzentrifugenspins durchgeführt werden oder wenn die zytosolische Fraktion nicht schnell geklärt wird. Wenn die zytosolische Fraktion nicht schnell genug geklärt wird, kann es zur Lyse von Zellfragmenten kommen, was zu einer Kontamination der zytosolischen Fraktion führt.

Wenn der Schritt der isopyknischen Dichtereinigung nicht durchgeführt wird, führt dies zu einer Kontamination der Membranfraktion (Abbildung 4, Bahn 4, alle Paneele), je nachdem, wie heterogen die Probe vor der Dichtereinigung ist. Die ordnungsgemäße Einhaltung aller Schritte des Protokolls ist entscheidend, um die gewünschte Trennung der subzellulären Fraktionen zu erreichen. Bei der Quantifizierung mit einem Bradford-Assay kann die Proteinausbeute für jede Fraktion bestimmt werden. Die erwartete Proteinausbeute pro Fraktion ist in Tabelle 1 angegeben. Es ist aus mehreren Gründen nützlich, einen Proteinquantifizierungstest durchzuführen, bevor Western Blots durchgeführt werden. Erstens bestätigt es, dass Fraktionen tatsächlich Protein enthalten; zweitens ermöglicht es das Laden von SDS-PAGE-Gelen basierend auf der Proteinmenge; und schließlich, unter der Annahme, dass die Proteinausbeuten den erwarteten ähnlich sind (Tabelle 1), bestätigt es die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zellfraktionierung. Eine Übersicht über das Zellfraktionierungsprotokoll, dargestellt als Flussdiagramm. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; CS = Zellsolubilisierung; NL = Kernlyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Isopyknische Dichtereinigung von rohen mitochondrialen und Membranfraktionen. (A) Repräsentativer Western Blot aller Fraktionen, die nach der Dichtegradientenreinigung der rohen mitochondrialen Fraktion gesammelt wurden. (B) Repräsentativer Western Blot aller Fraktionen, die nach der Dichtegradientenreinigung der Rohmembranfraktion gesammelt wurden. Beide Dichtegradientenreinigungen zeigen die Migration des mitochondrialen Markers VDAC für die 25% und 30% Iodixanol (v / v) -Fraktionen und die Migration des Membranmarkers Na, K + ATPase für die 10% und 15% Iodixanol (v / v) -Fraktionen. Abkürzung: VDAC = spannungsabhängiger Anionenkanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Erfolgreiche Isolierung von U937 zytosolischen, nuklearen, mitochondrialen und Membranfraktionen. (A) Repräsentative westliche Blots von Zellfraktionen, die mit dieser Technik aus einer U937-Zellkultur isoliert und auf Marker von Zytoplasma (GAPDH, erstes Panel), Zellkern (Histon H3, zweites Panel), Mitochondrien (VDAC, drittes Panel) und Membran (Na,K+ ATPase α1, viertes Panel) untersucht wurden. (B-E) Densitometrie von Western Blots von Zellfraktionen, die mit dieser Technik aus U937-Zellkulturen isoliert wurden. Die Ergebnisse stammen aus 3 unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Einweg-ANOVA. S<0,001. Abkürzungen: GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; VDAC = spannungsabhängiger Anionenkanal; cyto = zytosolisch; nuc = nuklear; mito = mitochondrial; mem = Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Unvollständige Fraktionierung von U937-Zellkomponenten. Repräsentative westliche Blots von Zellfraktionen, die aus einer U937-Zellkultur isoliert wurden, zeigten eine Kontamination der zytosolischen Fraktion mit Histon H3 (Bahn 1, zweites Panel) aufgrund einer unsachgemäßen Klärung dieser Fraktion und einer rohen Membranfraktion, die keiner isopyknischen Dichtegradientenreinigung unterzogen wurde (Bahn 4, alle Panels). Abkürzungen: cyto = zytosolisch; nuc = nuklear; mito = mitochondrial; mem = Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bruch Ausbeute (μg/ml) Standardabweichung Ungefähres Volumen
Zytoplasma 1500 146 5 ml
Kern 1200 172 500 μL
Mitochondrien 400 66 500 μL
Membran 200 23 500 μL

Tabelle 1: Proteinausbeute für jede subzelluläre Fraktion.

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Discussion

Dieses Verfahren ist eine modifizierte Version eines zuvor veröffentlichten Ansatzes zur subzellulären Fraktionierung ohne den Einsatz von Hochgeschwindigkeitszentrifugation11. Diese modifizierte Methode erfordert mehr spezialisierte Ausrüstung, um die besten Ergebnisse zu erzielen, ist aber umfassender und konsistent reproduzierbar.

Die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls war aufgrund der Unfähigkeit erforderlich, mitochondriale und Membranproben für die Analyse der Proteinlokalisation während der Nekroptose zu trennen12. Versuche, die ausschließlich waschmittelbasierten Methoden zu verwenden, die in den meisten handelsüblichen Kits zu finden sind, führten zu einer homogenen Mischung, die die Plasmamembran und alle membranumschlossenen Organellen in der Zelle enthielt. Weitere Einschränkungen dieser Kits sind die Unfähigkeit, Änderungen am Verfahren vorzunehmen, die Kosten pro Probe, Volumenbeschränkungen und die Anzahl der Proben, die verarbeitet werden können. Das hier vorgestellte Verfahren kann auf jede beliebige Skala geändert werden, um weniger Fraktionen zu isolieren, und kann ohne den Einsatz teurer Reagenzien durchgeführt werden. Die Fraktionsausbeute kann durch die Verwendung von mehr Zellen erhöht werden. Die Schritte können auf die durchgeführte Forschung zugeschnitten werden; und die Ausführung der Methode ist flexibel. Wenn Forscher beispielsweise eine bestimmte subzelluläre Fraktion nicht untersuchen, müssen sie diese Probe im Laufe des Verfahrens nicht isolieren. Ebenso kann auf die Zugabe bestimmter Inhibitoren oder Reagenzien verzichtet werden, wenn der Forscher nicht plant, den Phosphorylierungszustand von Proteinen (Natriumorthovanadat) zu untersuchen oder sich nicht um die Denaturierung von Proteinen (Hexylenglykol) kümmert.

Die Verwendung von Iodixanol als Dichtegradientenlösung ist optional; Dieses Reagenz stört jedoch nicht die nachfolgende Untersuchung von Proben mittels Western Blotting. Es ist auch möglich, das Jodaxanol durch Verdünnung und Zentrifugation aus Proben zu entfernen, um die Mitochondrien oder die Membran zurückzugewinnen, obwohl dies die endgültige Ausbeute beeinflusst. Andere alternative Dichtegradientenlösungen können verwendet werden, einschließlich Saccharose. Um optimale Ergebnisse und reine Brüche zu erhalten, müssen mehrere Faktoren und bestimmte kritische Schritte im Protokoll berücksichtigt werden, die sorgfältige Aufmerksamkeit erfordern. Dieses Protokoll ist für die Fraktionierung von U937-Zellen optimiert, und die Konzentration der Zellen, die an bestimmten Punkten des Protokolls empfohlen werden, ist spezifisch für diese Zelllinie. Diese Werte wurden empirisch ermittelt und müssen höchstwahrscheinlich für verschiedene Zelltypen angepasst werden, insbesondere wenn bei der Ausführung des Protokolls suboptimale Ergebnisse erzielt werden.

Die zytoplasmatische Probe sollte so bald wie möglich geklärt werden, um ungebrochene Zellen und Trümmer zu entfernen, die zu einer Kreuzkontamination durch Proteine aus anderen subzellulären Fraktionen führen könnten (Abbildung 4, Bahn 1, zweites Panel). Die Homogenisierung kann mit jeder Form der mechanischen Lyse durchgeführt werden, obwohl die hier vorgestellten Ergebnisse mit einem perlenbasierten Verfahren und einer Mischvorrichtung erzielt wurden. Alternative manuelle Formen der Homogenisierung (ein Dounce-Homogenisator oder Durchgang durch eine kleine Messnadel) können ebenfalls verwendet werden, können jedoch aufgrund der Variabilität der Technik durch die Person, die das Verfahren durchführt, zu Reproduzierbarkeitsproblemen führen. Das Interesse dieser Gruppe gilt vor allem zirkulierenden Leukozyten, weshalb bei diesem Verfahren U937-Zellen eingesetzt werden. Dieses Verfahren kann jedoch auf andere Suspensionszelllinien mit wahrscheinlich geringem Änderungsbedarf angewendet werden. Portionen, die möglicherweise angepasst werden müssen, um eine andere Suspensionszelllinie aufzunehmen, umfassen Zellkonzentrationen, die während des gesamten Verfahrens verwendet werden, sowie die Konzentration von Ditonin, das zur Extraktion der zytosolischen Fraktion verwendet wird.

Obwohl dieses Verfahren nicht für adhärente Zelllinien optimiert ist, kann es als Ausgangspunkt dienen, an dem Anpassungen vorgenommen werden können, um adhärente Zellen aufzunehmen. Diese Anpassungen umfassen die Zellkonzentration, die Konzentration von Digitonin und die Homogenisierungszeit. Darüber hinaus sind adhärente Zellen durch die Oberfläche begrenzt, während Suspensionszellen durch das Volumen begrenzt sind; Dies vereinfacht die Skalierung von Suspensionszellen. Um adhärente Zellen zu vergrößern, müssen Gewebekulturplatten mit einer großen Oberfläche (>500 cm2) verwendet werden. Dieses Verfahren ist eine kostengünstige, reproduzierbare subzelluläre Fraktionierung mit der Fähigkeit, zytosolische, nukleare, mitochondriale und Membranfraktionen mit großer Reinheit zu trennen. Einer der größten Vorteile dieses Verfahrens ist die Trennung der mitochondrialen von der Membranfraktion. Dies ist bei ausschließlich waschmittelbasierten Verfahren nicht möglich. Obwohl Detergenzien in diesem Verfahren verwendet werden, werden sie verwendet, um die Plasmamembran (Digonin) zu permebilisieren, aber nicht zu stören und die Kernfraktion nach der Isolierung der mitochondrialen und Membranfraktionen zu erhalten.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH R15-HL135675-01 und NIH 2 R15-HL135675-02 bis T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

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References

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  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Biochemie Ausgabe 174 Zelluläre Fraktionierung Kern Mitochondrien Membran Zytoplasma Organellen Ultrazentrifugation Dichtegradient U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

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William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung
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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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