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Biochemistry

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Abstract

Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.

Introduction

El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente1,2, basándose en el uso de tampones que contienen cantidades crecientes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Si bien este método es rápido y conveniente, da como resultado fracciones impuras. Estos están diseñados para permitir a los investigadores aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero no son lo suficientemente complejos como para aislar múltiples fracciones subcelulares de una muestra al mismo tiempo. Depender únicamente de detergentes generalmente da como resultado orgánulos encerrados en la membrana y la membrana plasmática se solubiliza indiscriminadamente, lo que dificulta la separación de estos componentes. Una complicación adicional del uso de estos kits es la incapacidad de los investigadores para alterarlos / optimizarlos para aplicaciones específicas, ya que la mayoría de los componentes son formulaciones patentadas. Finalmente, estos kits pueden ser prohibitivamente caros, con limitaciones en el número de usos que los hacen menos que ideales para muestras más grandes.

A pesar de la disponibilidad de kits para el aislamiento de mitocondrias que no dependen de detergentes, no están diseñados para aislar la membrana plasmática y producir cantidades significativamente menores de muestra que los protocolos de aislamiento estándar 3,4. Si bien los métodos de centrifugación diferencial requieren más tiempo, a menudo dan lugar a distintas fracciones que no se pueden obtener con kits exclusivamente a base de detergente1. La separación sin el uso exclusivo de detergentes solubilizantes también permite una purificación adicional mediante ultracentrifugación y gradientes de densidad isopícnica, lo que resulta en una menor contaminación cruzada. Este protocolo de fraccionamiento demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares de monocitos U937 utilizando una combinación de detergente y enfoques basados en centrifugación de alta velocidad. Este método facilitará el aislamiento de los componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriales y de membrana plasmática de una célula de mamífero con una contaminación mínima entre las fracciones.

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Protocol

1. Preparar tampones y reactivos

  1. Prepare soluciones frescas de inhibidores de la fosfatasa y la proteasa.
    1. Agregue 17.4 mg de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 ml de etanol al 100% para preparar un stock de 100 mM.
      NOTA: Use equipo de protección cuando manipule PMSF, ya que es peligroso cuando se ingiere o inhala y al entrar en contacto con la piel o los ojos. Es corrosivo para los ojos y la piel.
    2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare un cóctel de inhibidores de la proteasa disponible comercialmente (100x).
    3. Agregue 91.9 mg de ortovanadato de sodio (SOV) a 1 ml de agua desionizada para preparar un stock de 500 mM.
      NOTA: Use equipo de protección cuando manipule SOV, ya que es peligroso si se ingiere, inhala o al contacto con los ojos. La sobreexposición severa puede resultar en la muerte.
  2. Prepare el tampón de lisis A, el tampón de aislamiento citoplasmático (CI), el tampón de solubilización celular (CS), el tampón de lisis nuclear (NL), el tampón B de lisis, el tampón de homogeneización celular (CH), el diluyente de iodixanol y los detergentes.
    1. Añadir 8,7 g de cloruro de sodio (NaCl) y 50 ml de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES, 1 M, pH 7,4) a 950 ml de agua desionizada para preparar el tampón de lisis A (concentraciones finales de 150 mM NaCl y 50 mM HEPES).
    2. Preparar soluciones madre de detergentes de la siguiente manera: añadir 0,1 g de dodecil sulfato de sodio (SDS) a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final de 1% SDS), añadir 0,1 g de desoxicolato de sodio a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final del 1%), añadir 2,5 mg de digitonina a 10 ml de tampón de lisis A (concentración final de 250 μg/ml), y añadir 1 ml de detergente no iónico y no desnaturalizante (véase la Tabla de materiales) a 9 ml de tampón de lisis A (concentración final del 10% (v/v)).
    3. Prepare el tampón IC agregando 10 μL de stock de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM) y 100 μL de digitonina madre (250 μg/mL) a 878 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de proteasa, 1 mM SOV y 25 μg/ml de digitonina). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
    4. Preparar el tampón CS añadiendo 10 μL de material de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de la proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM), 100 μL de material de detergente no iónico y no desnaturalizante (véase la Tabla de materiales) (10%) y 118 μL de stock de hexilenglicol (8,44 M) a 760 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV, 1% no iónico, detergente no desnaturalizante y 1 M hexylene glycol). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
    5. Preparar el tampón NL añadiendo 10 μL de stock de PMSF (100 mM), 10 μL de inhibidor de la proteasa (100x), 2 μL de stock de SOV (500 mM), 50 μL de stock de desoxicolato de sodio (10%), 100 μL de stock de SDS (1%) y 118 μL de stock de hexylene glycol (8,44 M) a 710 μL de tampón de lisis A (concentraciones finales de 1 mM PMSF, 1x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV, 0,5% de desoxicolato de sodio (v/v), 0,1% de SDS (p/v) y 1 M de hexilenglicol). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet nuclear.
    6. Añadir 20 ml de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g de cloruro de potasio (KCl), 0,19 g de cloruro de magnesio (MgCl 2), 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético (0,5 M EDTA),2 ml de etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (0,5 M EGTA), 38,3 g de manitol y 23,9 g de sacarosa a 980 ml de agua desionizada para preparar tampón de lisis B (concentraciones finales de 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM manitol y 70 mM sacarosa).
    7. Preparar el tampón CH añadiendo 10 μL de material PMSF (100 mM) y 2 μL de stock SOV (500 mM) a 988 μL de tampón de lisis B (concentraciones finales de 1 mM PMSF y 1 mM SOV; ajuste el volumen final para acomodar el número de células que se están lisando). Mantenga la solución en hielo hasta que se agregue al pellet celular.
    8. Preparar el diluyente de iodixanol mediante la adición de 12 ml de HEPES (1 M, pH 7.4), 447 mg de KCl, 114 g de MgCl 2, 1.2 mL de 0.5 M EDTA,1.2 mL de 0.5 M EGTA, 21.3 g de manitol y 14.4 g de sacarosa a 88 mL de agua desionizada (concentraciones finales de 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM manitol y 420 mM sacarosa).
    9. Almacenar tampones a 4 °C y digitonina a -20 °C.

2. Aislamiento de proteínas citosólicas

NOTA: Los siguientes pasos permitirán el crecimiento y la expansión de las células U937 seguido de la extracción de proteínas citosólicas. A la concentración utilizada, la digitonina permeabilizará la membrana plasmática sin interrumpirla, permitiendo la liberación de proteínas citosólicas y la retención de otras proteínas celulares.

  1. Cultivar las células en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino a 37 °C y 5% deCO2. Asegúrese de que las células crezcan hasta un total final de 6 x 108 células.
    NOTA: En este protocolo, las células se contaron utilizando un hemocitómetro estándar y un microscopio.
  2. Centrifugar las células cultivadas a 400 × g durante 10 min. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente a una concentración final de 4 × 106 células/ml, y pipetear suavemente para romper los grumos.
  3. Centrifugar la suspensión celular a 400 × g durante 10 min para granular las células. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el tampón de lisis A helado (preparado en el paso 1.2.1) a una concentración final de 2 × 107 células/ml.
  4. Extraer 7,5 ml de las células suspendidas en el tampón de lisis A (3 × 107 células) y mantener en hielo para la extracción de proteínas nucleares (sección 6). Centrifugar la suspensión celular a 4 °C, 400 × g durante 10 min para granular las células.
    NOTA: Realice todos los pasos posteriores a 4 °C o en hielo, y preenfríe todos los tampones.
  5. Deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en tampón CI a una concentración final de 2 × 107 células/ml y pipetear suavemente para romper los grumos. Gire la suspensión celular de extremo a extremo a 4 °C durante 20 min.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 4 °C, 400 × g durante 10 min, y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Guarde la bolita celular y guárdela en hielo. Centrifugar el sobrenadante recogido a 4 °C, 18.000 × g durante 20 min para granular los restos celulares.
    NOTA: Este paso de centrifugación de alta velocidad es crítico para prevenir la contaminación de la fracción citosólica con orgánulos y proteínas unidas a la membrana.
  7. Deseche el pellet después de transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Repita ambos pasos de centrifugación en el paso 2.6 hasta que no se obtenga ningún pellet después de la centrifugación.
  8. Recoge el sobrenadante, que es la fracción citosólica. Para el almacenamiento a corto plazo (1 mes), asegúrese de que el sobrenadante se conserva a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo (>1 mes), combine el sobrenadante con 1x tampón Laemmli que contenga 1x agente reductor, caliente a 95 °C durante 7 min y guárdelo a -20 o -80 °C.
  9. Resuspender el pellet celular (a partir de la etapa 2.6) en el tampón de lisis A a una concentración final de 4 × 106 células/ml; pipeta suavemente para romper los grumos.

3. Homogeneización celular

NOTA: Los siguientes pasos permitirán la homogeneización mecánica de las células tratadas con digitonina (a partir del paso 2.9), que es necesaria para el aislamiento de las fracciones de proteínas mitocondriales y de membrana.

  1. Centrifugar la suspensión celular en el tampón de lisis A (preparado en el paso 2.9), guardar el pellet y desechar el sobrenadante para eliminar el exceso de digitonina y contaminantes citosólicos del pellet celular.
    NOTA: Se pueden realizar lavados repetidos en el tampón de lisis A para eliminar el exceso de contaminantes citosólicos.
  2. Resuspender el pellet celular en tampón CH helado (preparado en la etapa 1.2.7) a una concentración final de 4 × 106 células/ml. Incubar la suspensión celular en hielo durante 30 min.
  3. Si utiliza un método basado en cuentas para la lisis mecánica, coloque 30 g de perlas de acero inoxidable de 3,2 mm prelavadas en un tubo con faldón de 50 ml, llene con 15 ml de tampón B de lisis y colóquelas en hielo para enfriar. Si usa un homogeneizador Dounce (con un mortero B ajustado), llene con un volumen apropiado de tampón B de lisis, inserte el mortero y colóquelo en hielo para enfriar.
  4. Después de la incubación (paso 3.2), deseche el tampón de lisis B de los tubos de perlas (o homogeneizador Dounce) y transfiera 15 ml de la suspensión celular al tubo de perlas (o un volumen apropiado al homogeneizador).
  5. Si utiliza el método basado en cuentas, coloque los tubos de perlas con faldón que contienen la suspensión celular en el dispositivo de licuadora y configúrelos para que funcionen durante 5 minutos a una velocidad de 8. Si usa un homogeneizador Dounce, manténgalo en hielo y realice 40 pasadas con el mortero usando movimientos lentos y uniformes (o utilice un método alternativo de lisis celular mecánica como se detalla en la sección de discusión).
    NOTA: Si se utiliza un dispositivo mezclador diferente del utilizado aquí, es posible que la velocidad y el tiempo deban determinarse empíricamente.
  6. Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrífuga limpio y centrifugarlo a 400 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y guárdelo; Deseche el pellet.
    NOTA: El protocolo puede pausarse aquí y el homogeneizado almacenarse a 4 °C a corto plazo (24 h).

4. Remoción de escombros y aislamiento de fracciones mitocondriales y de membrana crudas

NOTA: Los siguientes pasos permitirán la eliminación de restos celulares mediante la centrifugación del homogeneizado a velocidades crecientes. Esto es seguido por la centrifugación diferencial para el aislamiento de fracciones mitocondriales y de membrana crudas.

  1. Centrifugar el homogeneizado (a partir del paso 3.6) a 500 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
  2. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.1) a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
  3. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.2) a 2.000 × g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y deseche cualquier pellet.
  4. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.3) a 4.000 × g durante 20 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y guarde el pellet, que es la fracción mitocondrial cruda.
  5. Centrifugar el sobrenadante (a partir del paso 4.4) a 18.000 × g durante 1 h a 4 °C. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet, que es la fracción de membrana cruda.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí, y las muestras peletizadas almacenadas a 4 °C a corto plazo (24 h).

5. Purificación del gradiente de densidad isopícnica

NOTA: Los siguientes pasos utilizan centrifugación por gradiente de densidad isopícnica para purificar las fracciones mitocondriales y de membrana crudas.

  1. Preparar una solución de trabajo al 50% (v/v) de iodixanol mezclando 1 parte de diluyente (preparado en la etapa 1.1.3) con 5 partes de iodixanol (solución madre al 60% (p/v)). Prepare soluciones de iodixanol al 10%, 15%, 20%, 25%, 30% y 35% (v/v) mezclando la solución de trabajo al 50% (v/v) con el tampón B de lisis en cantidades apropiadas.
  2. Resuspender los gránulos mitocondriales y de membrana crudos (de los pasos 4.4 y 4.5) cada uno en 200 μL de tampón de lisis B. Ajustar al 45% de iodixanol (v/v) añadiendo 1800 μL de solución de iodixanol de trabajo (50% (v/v)) a 200 μL del pellet resuspendido.
  3. Cree un gradiente discontinuo de iodixanol de la siguiente manera (ajuste los volúmenes según corresponda para la capacidad del tubo de ultracentrífuga): Agregue 1 ml de iodixanol (v/v) al 15% en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga de pared delgada de 8 ml, abierto y de pared delgada, coloque 1 ml de iodixanol al 20% (v / v) debajo de la primera capa (mediante la técnica subyacente), seguido de 1 ml subyacente de 25 %, 1 ml de 30% y 1 ml de iodixanol al 35% (v/v).
    NOTA: Debe haber 2 gradientes creados en este paso, 1 para la fracción mitocondrial y 1 para la fracción de membrana.
  4. En 1 gradiente, agregue los 2 ml del pellet mitocondrial crudo (suspendido en 45% de iodixanol (v / v)) utilizando la técnica de capa subyacente al fondo del tubo debajo del 35% de iodixanol (v / v). En el otro gradiente, agregue los 2 ml del pellet de membrana cruda (suspendido en 45% de iodixanol (v / v)) utilizando la técnica de capa inferior al fondo del tubo debajo del 35% de iodixanol (v / v).
  5. Agregue 1 ml de yododinanol al 10% (v/v) a la parte superior de cada tubo de gradiente superponiéndolo sobre la capa del 15%. Equilibrar los tubos dentro de 0,1 g entre sí mediante la adición de 10% de iodixanol (v / v).
  6. Girar los tubos de gradiente de densidad a 4 °C durante 18 h a 100.000 × g. Asegúrese de ajustar la aceleración y la desaceleración a los valores mínimos para la ultracentrífuga que se está utilizando.
    NOTA: En el gradiente mitocondrial, habrá una banda visible en la interfaz entre 25% y 30% de iodixanol (v/v). Esta es la fracción mitocondrial pura. En el gradiente de membrana, habrá una banda visible en la fracción de iodixanol (v/v) al 15%. Esta es la fracción de membrana pura. Puede haber bandas adicionales en las fracciones de yododinanol (v/v) del 25% y 30% en el gradiente de membrana. Esto es contaminación mitocondrial.
  7. Recoger fracciones de la parte superior del tubo en alícuotas de 1 ml, teniendo cuidado de minimizar el volumen de la fracción que contiene las bandas visibles y cambiando la punta de la pipeta después de recoger cada capa. Alternativamente, perfore el lado del tubo de paredes delgadas con una aguja y recoja las bandas visibles.
  8. Conservar las muestras como se describe en el paso 2.8 hasta su verificación mediante ensayo de proteínas y Western blot.

6. Aislamiento de proteínas nucleares

NOTA: Utilizando detergentes iónicos y no iónicos, así como técnicas como la sonicación y la centrifugación, los siguientes pasos solubilizarán todas las membranas celulares y permitirán el aislamiento de proteínas nucleares.

  1. Centrifugar la alícuota de 7,5 ml de células suspendidas en el tampón de lisis A (a partir del paso 2.4) y desechar el sobrenadante. Añadir 800 μL de tampón CS helado (preparado en el paso 1.2.4) y resuspender el pellet mediante pipeteo y vórtice. Incubar las muestras en hielo (o a 4 °C) durante 30 minutos para interrumpir las membranas plasmáticas y de orgánulos mientras se protegen las proteínas nucleares.
  2. Centrifugar la suspensión celular a 7.000 × g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Añadir 800 μL de tampón NL helado (preparado en la etapa 1.2.5) al pellet nuclear después de la inclusión de 1U/μL de benzonasa. Vuelva a suspender el pellet pipeteando suavemente. Incubar en un rotador de extremo a extremo durante 30 min a 4 °C para interrumpir la membrana nuclear.
  3. Sonicate durante 5 s al 20% de potencia con tubos de muestra enfriados en un baño de hielo (3x, con 5 s de pausas entre pulsos), que junto con la benzonasa (añadida en el paso 6.2), cortará los ácidos nucleicos.
  4. Centrifugar el sonicado a 7.800 × g durante 10 min a 4 °C. Recoge y guarda el sobrenadante, que es la fracción nuclear. Asegúrese de no perturbar el pellet insoluble mientras recoge el sobrenadante. Para el almacenamiento, las muestras se pueden preparar como se describe en el paso 2.8.

7. Cuantificación de proteínas y análisis de Western blot

NOTA: Los siguientes pasos cuantificarán la proteína total en cada fracción y confirmarán la pureza de las fracciones subcelulares.

  1. Realice un ensayo estándar de Bradford para cuantificar la proteína total en cada fracción. Consulte la Tabla 1 para conocer los rendimientos de proteínas esperados.
    NOTA: Se pueden usar otros ensayos de proteínas como el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) o la absorbancia a 280 nm para medir la proteína total en lugar de un ensayo de Bradford.
  2. Combinar fracciones con 1x tampón Laemmli que contenga 1x agente reductor, y calentar a 95 °C durante 7 min. Cargue 10 μg de cada fracción en un gel estándar de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ejecute el gel a 20 mA durante 1 h.
  3. Transfiera las proteínas resueltas a una membrana de polivinildifluoruro (PVDF) realizando una transferencia de inmunotransferencia estándar a 100 V durante 30 min. Bloquear la membrana de PVDF con leche al 5% en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,1% de un detergente no iónico (v/v) durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Añadir los anticuerpos primarios apropiados para detectar proteínas de mantenimiento específicas para cada fracción subcelular, e incubar durante la noche a 4 °C. Lavar la membrana con leche al 5% en 1x TBS que contengan 0,1% del detergente no iónico (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Para este protocolo, se utilizaron anticuerpos contra gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, 1:10000), histona H3 (1:2000), canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC, 1:1000) y Na,K+-ATPasa para fracciones citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana, respectivamente.
  5. Agregue los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiados a la membrana (diluir de acuerdo con las instrucciones del fabricante) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar la membrana con leche al 5% en 1x TBS que contengan 0,1% del detergente no iónico (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente. Desarrolle el blot utilizando quimioluminiscencia estándar.

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Representative Results

Un diagrama de flujo esquemático de este procedimiento (Figura 1) resume visualmente los pasos que se tomaron para fraccionar con éxito las células U9375 cultivadas en suspensión. Las fracciones recogidas de la parte superior del gradiente de densidad isopícnica en volúmenes iguales (1 mL) muestran la purificación de las fracciones mitocondrial y de membrana (Figura 2). La utilización de un anticuerpo contra VDAC, una proteína localizada en la membrana mitocondrial externa6, muestra que la fracción mitocondrial migró a las fracciones de iodixanol (v/v) al 25% y 30% (Figura 2A). El uso de un anticuerpo contra la subunidad α1 de Na,K+-ATPasa, parte de un heterodímero integral de membrana que se encuentra principalmente en la membrana plasmática7, muestra la separación de la contaminación de la membrana de la fracción mitocondrial pura (Figura 2A). La fracción de membrana pura migró a las fracciones menos densas, 10% y 15% de iodixanol (v/v) (Figura 2B). La contaminación mitocondrial de la fracción de membrana fue separada por el gradiente.

Un western blot8 realizado con los marcadores de localización adicionales (referenciados en el paso 7.4) muestra la pureza de las fracciones citosólica y nuclear, al tiempo que verifica adicionalmente que las muestras mitocondriales y de membrana están libres de contaminación por proteínas de otras partes de la célula (Figura 3). El uso de un anticuerpo contra GAPDH, normalmente localizado en el citoplasma de la célula9, muestra que esta proteína solo se encuentra en la fracción citosólica (Figura 3A, Carril 1, primer panel), y que no se observa contaminación en las proteínas nucleares extraídas, las mitocondrias purificadas por densidad o las fracciones de membrana (Figura 3A; carriles 2, 3 y 4; primer panel). El sondeo de la histona H3, una proteína que se encuentra en el núcleo e involucrada en la estructura de la cromatina10, muestra una extracción nuclear exitosa (Figura 3A, Carril 2, segundo panel), con una detección mínima en la fracción citoplasmática y sin contaminación cruzada en las fracciones mitocondriales o de membrana.

El sondeo de VDAC en todas las fracciones muestra la presencia de esta proteína en la fracción mitocondrial pura (Figura 3A, Carril 3, tercer panel), y que no existe contaminación cruzada en las otras fracciones (Figura 3A; carriles 1, 2 y 4; tercer panel). El sondeo de la subunidad Na/K-ATPasa α1 muestra de manera similar que esta proteína se encuentra solo en la fracción de membrana pura (Figura 3A, Carril 4, cuarto panel). Estas fracciones fueron analizadas por densitometría para confirmar la reproducibilidad y significación estadística (Figura 3B-E). En contraste con los resultados del fraccionamiento exitoso (Figura 3), la ejecución incorrecta de este método (o el incumplimiento de todos los pasos recomendados) puede resultar en la contaminación cruzada de los componentes celulares (Figura 4). Una alta concentración de histona H3 en la fracción citosólica (Figura 4, carril 1, segundo panel) puede resultar de una falla en aclarar adecuadamente la fracción citosólica (referenciada en el paso 2.6). Esto puede ocurrir si no se realizan suficientes centrifugadores de clarificación o si la fracción citosólica no se aclara rápidamente. Si la fracción citosólica no se aclara lo suficientemente rápido, puede resultar en la lisis de fragmentos celulares, lo que lleva a la contaminación de la fracción citosólica.

Si no se realiza el paso de purificación de densidad isopícnica, se contaminará la fracción de membrana (Figura 4, Carril 4, todos los paneles), dependiendo de cuán heterogénea sea la muestra antes de la purificación por densidad. El cumplimiento adecuado de todos los pasos del protocolo es fundamental para obtener la separación deseada de las fracciones subcelulares. Cuando se cuantifica utilizando un ensayo de Bradford, se puede determinar el rendimiento de proteínas para cada fracción. El rendimiento proteico esperado por fracción se informa en la Tabla 1. Es útil realizar un ensayo de cuantificación de proteínas antes de realizar Western blots por varias razones. En primer lugar, confirma que las fracciones contienen proteínas; segundo, permite la carga de geles SDS-PAGE basados en la cantidad de proteínas; y finalmente, suponiendo que los rendimientos de proteínas son similares a los esperados (Tabla 1), confirma la ejecución adecuada del procedimiento.

Figure 1
Figura 1: Diagrama del procedimiento de fraccionamiento celular. Una descripción general del protocolo de fraccionamiento celular representado como un diagrama de flujo. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; CS = solubilización celular; NL = lisis nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Purificación de densidad isopínica de fracciones mitocondriales y de membrana crudas . (A) Western blot representativo de todas las fracciones recogidas después de la purificación por gradiente de densidad de la fracción mitocondrial cruda. (B) Western blot representativo de todas las fracciones recogidas después de la purificación por gradiente de densidad de la fracción de membrana cruda. Ambas purificaciones de gradiente de densidad muestran la migración del marcador mitocondrial, VDAC, para las fracciones de yododinanol (v/v) del 25% y el 30% y la migración del marcador de membrana, Na,K+ ATPasa, para las fracciones de iodixanol (v/v) del 10% y 15%. Abreviatura: VDAC = canal aniónico dependiente del voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aislamiento exitoso de fracciones citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana de U937. (A) Lotes occidentales representativos de fracciones celulares aisladas de un cultivo celular U937 con esta técnica y sondeadas para marcadores de citoplasma (GAPDH, primer panel), núcleo (Histona H3, segundo panel), mitocondrias (VDAC, tercer panel) y membrana (Na,K+ ATPasa α1, cuarto panel). (B-E) Densitometría de Western blots de fracciones celulares aisladas de cultivos celulares U937 con esta técnica. Los resultados son de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan una desviación estándar. ANOVA unidireccional. p<0,001. Abreviaturas: GAPDH = gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; VDAC = canal aniónico dependiente del voltaje; cyto = citosólico; nuc = nuclear; mito = mitocondrial; mem = membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Fraccionamiento incompleto de componentes celulares U937. TWestern blots representativos de fracciones celulares aisladas de un cultivo celular U937 que muestran contaminación de la fracción citosólica con histona H3 (carril 1, segundo panel) debido a una clarificación inadecuada de esta fracción y una fracción de membrana cruda que no se sometió a purificación de gradiente de densidad isopícnica (carril 4, todos los paneles). Abreviaturas: cyto = citosólica; nuc = nuclear; mito = mitocondrial; mem = membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fracción Rendimiento (μg/mL) Desviación estándar Volumen aproximado
Citoplasma 1500 146 5 ml
Núcleo 1200 172 500 μL
Mitocondria 400 66 500 μL
Membrana 200 23 500 μL

Tabla 1: Rendimiento proteico para cada fracción subcelular.

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Discussion

Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad11. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.

El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localización de proteínas durante la necroptosis12. Los intentos de utilizar los métodos exclusivamente a base de detergente que se encuentran en la mayoría de los kits disponibles comercialmente dieron como resultado una mezcla homogénea que contiene la membrana plasmática y todos los orgánulos encerrados en la membrana en la célula. Otras limitaciones de estos kits incluyen la incapacidad de realizar alteraciones en el procedimiento, el costo por muestra, las restricciones de volumen y el número de muestras que se pueden procesar. El procedimiento presentado aquí puede modificarse a cualquier escala, cambiarse para aislar menos fracciones y puede realizarse sin el uso de reactivos costosos. Los rendimientos de fracción se pueden aumentar utilizando más células; los pasos se pueden adaptar a la investigación que se está realizando; y la ejecución del método es flexible. Por ejemplo, si los investigadores no están examinando una fracción subcelular en particular, no necesitan aislar esa muestra en el curso del procedimiento. Del mismo modo, la adición de inhibidores o reactivos particulares puede omitirse si el investigador no planea estudiar el estado de fosforilación de las proteínas (ortovanadato de sodio) o no está preocupado por las proteínas desnaturalizantes (hexylene glycol).

El uso de iodixanol como solución de gradiente de densidad es opcional; Sin embargo, este reactivo no interfiere con el examen posterior de las muestras mediante Western Blotting. También es posible eliminar el iodaxanol de las muestras por dilución y centrifugación para recuperar las mitocondrias o membrana, aunque esto afectará el rendimiento final. Se pueden usar otras soluciones alternativas de gradiente de densidad, incluida la sacarosa. Para obtener resultados óptimos y fracciones puras, hay varios factores a considerar, y pasos críticos particulares en el protocolo que requieren una atención cuidadosa. Este protocolo está optimizado para el fraccionamiento de células U937, y la concentración de células recomendadas en puntos particulares del protocolo son específicas para esta línea celular. Estos valores se determinaron empíricamente y lo más probable es que deban ajustarse para diferentes tipos de células, en particular, si se obtienen resultados subóptimos al ejecutar el protocolo.

La clarificación de la muestra citoplasmática debe ocurrir tan pronto como sea posible para eliminar las células intactas y los desechos que podrían resultar en contaminación cruzada por proteínas de otras fracciones subcelulares (Figura 4, Carril 1, segundo panel). La homogeneización se puede lograr con cualquier forma de lisis mecánica, aunque los resultados presentados aquí se obtuvieron utilizando un método basado en cuentas y un dispositivo mezclador. También se pueden utilizar formas manuales alternativas de homogeneización (un homogeneizador Dounce o paso a través de una aguja de calibre pequeño), pero pueden dar lugar a problemas de reproducibilidad debido a la variabilidad de la técnica por parte de la persona que realiza el procedimiento. El interés de este grupo es principalmente en los leucocitos circulantes, por lo que las células U937 se utilizan en este procedimiento. Sin embargo, este procedimiento se puede aplicar a otras líneas celulares de suspensión con probablemente poca necesidad de alteración. Las porciones que pueden necesitar ser ajustadas para acomodar otra línea celular de suspensión incluyen las concentraciones celulares utilizadas durante todo el procedimiento, así como la concentración de digitonina utilizada para extraer la fracción citosólica.

Si bien no está optimizado para líneas celulares adherentes, este procedimiento puede servir como punto de partida para hacer ajustes para acomodar las células adherentes. Estos ajustes incluyen la concentración celular, la concentración de digitonina y el tiempo de homogeneización. Además, las células adherentes están limitadas por el área de superficie, mientras que las células de suspensión están limitadas por el volumen; Esto simplifica la ampliación de las células de suspensión. Para ampliar las células adherentes, se deben utilizar placas de cultivo de tejidos con una gran superficie (>500 cm2). Este procedimiento es un fraccionamiento subcelular rentable y reproducible con la capacidad de separar fracciones citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana con gran pureza. Una de las mayores ventajas de este procedimiento es la separación de la fracción mitocondrial de la membrana. Esto no es posible en procedimientos exclusivamente a base de detergente. Aunque los detergentes se utilizan en este procedimiento, se utilizan para permeabilizar, pero no interrumpir la membrana plasmática (digitonina) y para obtener la fracción nuclear después del aislamiento de las fracciones mitocondrial y de membrana.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH R15-HL135675-01 y NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

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References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Bioquímica Número 174 Fraccionamiento celular Nuclear Mitocondrias Membrana Citoplasma Orgánulos Ultracentrifugación Gradiente de densidad U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

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William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica
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McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

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