Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen
Summary
Deze film en het protocol zijn bedoeld om te leren nucleaire transfer.
Abstract
Kernenergie te zetten in een onbevruchte eicel kan herstellen ontwikkelingsstoornissen potentieel om een gedifferentieerde cel. Dit toont aan dat de processen die ten grondslag liggen ontwikkeling, differentiatie en veroudering zijn epigenetische in plaats van genetische processen. De omkeerbaarheid van deze processen opent opwindende perspectieven in fundamenteel onderzoek, en in de verdere toekomst, in de regeneratieve geneeskunde. In de muis, kunnen embryonale stamcellen worden afgeleid uit gekloonde embryo's pre-implantatie fase. Dergelijke embryonale stamcellen hebben het vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het volwassen organisme. Belangrijk is dat deze cellen zijn genetisch identiek aan de donor. Indien van toepassing op de mens, zou dit mogelijk de winning van stamcellen uit een patiënt. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderverdeeld in de getroffen celtype van de patiënt en bestudeerd in vitro, of worden gebruikt om de beschadigde of ontbrekende cellen te vervangen. De studie van nucleaire transfer in de muis blijft belangrijk want het kan ons informeren over de principes van de nucleaire herprogrammering. Deze film en de bijbehorende protocol zijn bedoeld om het leren nucleaire transfer in de muis, een methode in eerste instantie ontwikkeld in de groep van prof. dr. Yanagimachi (Wakayama et al.. 1998).
Protocol
Discussion
Good luck!
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DE zou graag Dr Hide Akutsu bedanken voor het delen van zijn NT trucs en dr. Stephen Sullivan en Garrett Birkhoff voor de kritische lezing van het protocol.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cytochalastin B | Sigma | 100x stock = 500 ug/mL Cytochalasin B in DMSO. Store at -20˚ C. | ||
| Strontium Chloride | 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature. | |||
| MCZB Stock Salts | Filter sterilize 500 mL master salts (good for 3-4 months; store at 4˚ C) | |||
| HCZB Stock Salts | Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4˚ C). | |||
| PVA | Sigma | P-8136 | cold-soluble | |
| HCZB with 11% w/v PVP | Start with 20 ml HCZB medium in a 50 mL conical tube. Place 22g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4˚ C for 72 – 96 hrs, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4˚ C. | |||
| PVP | ICN Biochemicals | MW 360000 |
References
- Eggan, K., Jaenisch, R., Pease, S., Lois, C. . Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. , (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., Press, C. S. H. L. . Manipulating the mouse embryo. , (2003).
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).
