قياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة باستخدام فحص كولوريمتري قائم على الباثوفينانثرولين
Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار لوني بسيط وراسخ يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات.
Abstract
الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية. كل من الحمل الزائد للحديد ونقصه ضاران للغاية بالبشر ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. كان استخدام النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدا لتعزيز المعرفة بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن الحديد. عادة ما يتم قياس مستويات الحديد الكلية في الأنسجة الحيوانية باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري أو باستخدام فحص قياس الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. لسنوات عديدة ، تم استخدام فحص الألوان لقياس محتوى الحديد غير الهيم في مجموعة واسعة من الأنسجة الحيوانية. على عكس التحليل الطيفي للامتصاص الذري ، فإنه يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن، وبالتالي يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات. وأخيرا، يمكن أن يكون الفحص اللوني إما قائما على كوفيت أو متكيفا مع تنسيق صفيحة صغيرة، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يوفر هذا العمل بروتوكولا راسخا مناسبا للكشف عن التغيرات في مستويات الحديد في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد أو نقص الحديد.
Introduction
الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية ، اللازمة لوظيفة البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحاسمة مثل نقل الأكسجين أو إنتاج الطاقة أو تخليق الحمض النووي. الأهم من ذلك ، أن كل من فائض الحديد ونقص الحديد ضاران للغاية بصحة الإنسان ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. يعد امتصاص الحديد الغذائي غير الطبيعي ، والوجبات الغذائية التي تعاني من نقص الحديد ، وعمليات نقل الدم المتكررة ، والالتهابات المزمنة من الأسباب الشائعة للاضطرابات المرتبطة بالحديد التي تؤثر على مليارات الأشخاص في جميع أنحاء العالم1،2،3.
كانت النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدة لتعزيز معرفتنا بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن الحديد4. وعلى الرغم من التقدم الكبير المحرز خلال العقدين الماضيين، لا تزال العديد من الجوانب الرئيسية بعيدة المنال. في السنوات القادمة ، سيظل القياس الدقيق لمستويات الحديد الإجمالية في الأنسجة الحيوانية خطوة حاسمة للمضي قدما في البحث في مجال بيولوجيا الحديد.
تقوم معظم المختبرات بقياس كمية حديد الأنسجة إما باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري (AAS) أو قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS) أو فحص الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. يعتمد هذا الأخير على الطريقة الأصلية التي وصفها تورانس وبوثويل منذ أكثر من 50 عاما5,6. في حين تم تطوير شكل مختلف من هذه الطريقة في وقت لاحق باستخدام الفيروزين كبديل ل bathophenanthroline7 ، فإن هذا الأخير لا يزال الكاشف الكروموجيني الأكثر استشهادا على نطاق واسع في الأدبيات.
تعتمد طريقة الاختيار غالبا على الخبرة والبنية التحتية المتاحة. في حين أن AAS و ICP-MS أكثر حساسية ، إلا أن اختبار قياس الألوان لا يزال يستخدم على نطاق واسع لأنه يقدم المزايا الهامة التالية: أ) يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. ب) لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن ؛ و iii) يمكن تكييف الفحص الأصلي القائم على cuvette مع تنسيق microplate ، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يستخدم نهج قياس الألوان المقدم في هذا العمل بشكل روتيني لقياس التغيرات في مستويات الحديد غير الهيم في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد الزائد أو نقص الحديد ، من القوارض إلى الأسماك وذبابة الفاكهة. هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار بسيط وراسخ ومقياس الألوان يجب أن تجده معظم المختبرات سهل التنفيذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، وذلك باستخدام تكييف لفحص الألوان القائم على bathophenanthroline الذي وصفه تورانس و Bothwell5,6 في الأصل. الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة هي تجفيف عينات الأنسجة. تمسخ البروتين وإطلاق الحديد غير العضوي عن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل الصناديق الوطنية من خلال FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.، في إطار المشروع UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
