バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定
Summary
ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。
Abstract
鉄は必須の微量栄養素です。鉄の過負荷と欠乏の両方がヒトにとって非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されている。鉄過負荷または欠乏症の実験動物モデルの使用は、鉄恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムの知識を進歩させるのに役立ってきた。動物組織における総鉄レベルの測定は、一般に、原子吸光分光法または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイを用いて行われる。長年にわたり、比色アッセイは、広範囲の動物組織における非ヘム鉄含有量の測定に使用されてきた。原子吸光分光法とは異なり、赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。さらに、高度な分析スキルや高価な機器を必要としないため、ほとんどのラボで簡単に実装できます。最後に、比色アッセイはキュベットベースにすることも、マイクロプレート形式に適合させることもできるため、サンプルスループットが向上します。本研究は、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化の検出に適した十分に確立されたプロトコールを提供する。
Introduction
鉄は必須微量栄養素であり、酸素輸送、エネルギー生産、DNA合成などの重要な生物学的プロセスに関与するタンパク質の機能に必要です。重要なことに、鉄の過剰と鉄欠乏の両方が人間の健康に非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されています。異常な食事による鉄吸収、鉄欠乏食、反復輸血、慢性炎症は、世界中の何十億人もの人々に影響を与える鉄関連疾患の一般的な原因です1,2,3。
鉄の過負荷または欠乏症の実験動物モデルは、鉄の恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムに関する我々の知識を進歩させるのに役立ってきた4。過去20年間に達成された実質的な進歩にもかかわらず、多くの重要な側面は依然としてとらえどころのないままです。今後数年間で、動物組織中の総鉄濃度の正確な測定は、鉄生物学分野の研究を進めるための重要なステップであり続けるでしょう。
ほとんどの研究室では、原子吸光分析法(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)、または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイのいずれかを使用して組織鉄を定量しています。後者は、50年以上前にトーランスとボスウェルによって記述された元の方法に基づいています5,6。この方法の変形は、その後、バソフェナントロリン7の代替としてフェロジンを使用して開発されたが、後者は文献の中で最も広く引用された発色試薬のままである。
選択方法は、多くの場合、利用可能な専門知識とインフラストラクチャによって異なります。AASおよびICP-MSはより感度が高いが、比色アッセイは、以下の重要な利点を提示するため、広く使用されている:i)赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。ii)高度な分析スキルや非常に高価な機器を必要としない。iii)元のキュベットベースのアッセイをマイクロプレート形式に適合させることができ、より高いサンプルスループットを可能にする。この研究で提示された比色法は、げっ歯類から魚やショウジョウバエまで、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織非ヘム鉄レベルの変化を定量化するために日常的に使用されている。ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの研究室が実装しやすいと感じるべき、シンプルで十分に確立された比色アッセイを使用して提供されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
動物組織中の非ヘム鉄含有量の測定のためのプロトコルが、トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリンベースの比色アッセイの適応を用いて提供される。この方法の重要なステップは、組織サンプルの乾燥である。酸加水分解によるタンパク質変性および無機鉄の放出;還元剤チオグリコール酸の存在下での第二鉄(<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、プロジェクトUIDB/04293/2020の下で、FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.を通じて国家基金によって資金提供されました。
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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