使用基于菲咯啉的比色法测量组织非血红素铁含量
Summary
在这里，提供了一种测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用一种简单，成熟的比色法，可以在大多数实验室中轻松实施。
Abstract
铁是一种必需的微量营养素。铁超负荷和缺乏都对人类非常有害，组织铁水平受到精细调节。铁超负荷或缺乏的实验动物模型的使用有助于提高铁稳态的全身和细胞调节机制的知识。动物组织中总铁水平的测量通常使用原子吸收光谱或基于非血红素铁与菲罗啉试剂反应的比色测定进行。多年来，比色测定法一直用于测量各种动物组织中的非血红素铁含量。与原子吸收光谱不同，它排除了来自红细胞中含有的血红蛋白的血红素铁的贡献。此外，它不需要复杂的分析技能或昂贵的设备，因此可以在大多数实验室中轻松实施。最后，比色法可以基于比色皿，也可以适应微孔板形式，从而实现更高的样品通量。本工作提供了一个完善的方案，适用于检测铁超载或缺铁的各种实验动物模型中组织铁水平的改变。
Introduction
铁是一种必需的微量营养素，是参与关键生物过程（如氧气运输、能量产生或DNA合成）的蛋白质功能所必需的。重要的是，铁过量和缺铁都对人体健康非常有害，组织铁水平受到精细调节。饮食中铁吸收异常、缺铁饮食、反复输血和慢性炎症是影响全球数十亿人的铁相关疾病的常见原因1，2，3。
铁超负荷或缺乏的实验动物模型有助于提高我们对铁稳态的全身和细胞调节机制的了解4。尽管在过去二十年中取得了重大进展，但许多关键方面仍然难以捉摸。在未来几年，准确测量动物组织中的总铁水平仍将是推进铁生物学领域研究的关键一步。
大多数实验室使用原子吸收光谱（AAS），电感耦合血浆质谱（ICP-MS）或基于非血红素铁与菲螺母试剂反应的比色测定来定量组织铁。后者基于Torrance和Bothwell在50多年前描述的原始方法5，6。虽然随后开发了该方法的变体，采用亚铁嗪作为菲咯啉的替代品7，但后者仍然是文献中引用最广泛的显色试剂。
选择的方法通常取决于可用的专业知识和基础结构。虽然AAS和ICP-MS更敏感，但比色测定仍然被广泛使用，因为它具有以下重要优点：i）它排除了来自红细胞中含有的血红蛋白的血红素铁的贡献;ii）它不需要复杂的分析技能或昂贵的设备;iii）原始的基于比色皿的测定可以适应微孔板形式，从而实现更高的样品通量。这项工作中提出的比色方法通常用于量化从啮齿动物到鱼和果蝇的各种铁超载或缺铁实验动物模型中组织非血红素铁水平的变化。在这里，提供了一种测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用简单，成熟的比色测定法，大多数实验室应该发现易于实施。
Protocol
Representative Results
Discussion
提供了测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用最初由Torrance和Bothwell描述的基于菲罗啉的比色测定法的适应性5，6。该方法的关键步骤是组织样品干燥;蛋白质变性并通过酸水解释放无机铁;在还原剂硫代乙醇酸存在下将铁（Fe3 +）还原为亚铁状态（Fe2 +），并将其与菲咯啉试剂反应（染色原反应）;所得黑色离子/菲咯啉粉红色复合物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由国家基金通过FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia，I.P.资助，在UIDB/04293/2020项目下。
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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