Измерение содержания негемового железа в тканях с помощью колориметрического анализа на основе батофенантролина
Summary
Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который может быть легко реализован в большинстве лабораторий.
Abstract
Железо является важным микроэлементом. Как перегрузка железом, так и его дефицит очень вредны для человека, а уровень железа в тканях точно регулируется. Использование экспериментальных животных моделей перегрузки или дефицита железа сыграло важную роль в углублении знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза железа. Измерение общего уровня железа в тканях животных обычно выполняется с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантроловым реагентом. В течение многих лет колориметрический анализ использовался для измерения содержания негемового железа в широком диапазоне тканей животных. В отличие от атомно-абсорбционной спектроскопии, она исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах. Кроме того, он не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования и, таким образом, может быть легко реализован в большинстве лабораторий. Наконец, колориметрический анализ может быть либо на основе кюветы, либо адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Настоящая работа обеспечивает хорошо зарекомендовавший себя протокол, который подходит для обнаружения изменений в уровнях железа в тканях в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных.
Introduction
Железо является важным микроэлементом, необходимым для функции белков, участвующих в важнейших биологических процессах, таких как транспорт кислорода, производство энергии или синтез ДНК. Важно отметить, что как избыток железа, так и дефицит железа наносят большой ущерб здоровью человека, а уровни железа в тканях точно регулируются. Аномальное усвоение железа с пищей, диеты с дефицитом железа, повторные переливания крови и хроническое воспаление являются распространенными причинами связанных с железом расстройств, которые затрагивают миллиарды людей во всем мире1,2,3.
Экспериментальные животные модели перегрузки или дефицита железа сыграли важную роль в продвижении наших знаний о механизмах, участвующих в системной и клеточной регуляции гомеостаза железа4. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый за последние два десятилетия, многие ключевые аспекты остаются недостижимыми. В ближайшие годы точное измерение общего уровня железа в тканях животных останется важным шагом для продвижения исследований в области биологии железа.
Большинство лабораторий количественно оценивают тканевое железо с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), масс-спектрометрии плазмы с индуктивной связью (ICP-MS) или колориметрического анализа, основанного на реакции негемового железа с батофенантролиновым реагентом. Последний основан на оригинальном методе, описанном Торрансом и Ботвеллом более 50 лет назад5,6. В то время как вариация этого метода была впоследствии разработана с использованием феррозина в качестве альтернативы батофенантролину7, последний остается наиболее широко цитируемым хромогенным реагентом в литературе.
Выбор метода часто зависит от имеющихся знаний и инфраструктуры. В то время как ААС и ВЧП-МС более чувствительны, колориметрический анализ остается широко используемым, поскольку он представляет следующие важные преимущества: i) он исключает вклад гемового железа, полученного из гемоглобина, содержащегося в эритроцитах; ii) не требует сложных аналитических навыков или дорогостоящего оборудования; и iii) оригинальный анализ на основе кюветы может быть адаптирован к формату микропластины, что обеспечивает более высокую пропускную способность образца. Колориметрический подход, представленный в этой работе, обычно используется для количественной оценки изменений в тканевых негемовых уровнях железа в различных экспериментальных моделях перегрузки железа или дефицита железа на животных, от грызунов до рыб и плодовой мухи. Здесь представлен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием простого, хорошо зарекомендовавшего себя колориметрического анализа, который большинство лабораторий должны найти простым в реализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приведен протокол измерения содержания негемового железа в тканях животных с использованием адаптации колориметрического анализа на основе батофенантролина, первоначально описанного Торрансом и Ботвеллом5,6. Критическими этапами метода являются сушк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась национальными фондами через FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., в рамках проекта UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
