Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina
Summary
Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.
Abstract
O ferro é um micronutriente essencial. Tanto a sobrecarga de ferro quanto a deficiência são altamente prejudiciais para os seres humanos, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. O uso de modelos animais experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro tem sido fundamental para o avanço do conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase de ferro. A medição dos níveis totais de ferro em tecidos animais é comumente realizada com espectroscopia de absorção atômica ou com um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Por muitos anos, o ensaio colorimétrico tem sido usado para a medição do teor de ferro não-heme em uma ampla gama de tecidos animais. Ao contrário da espectroscopia de absorção atômica, exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos. Além disso, não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros, podendo, assim, ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios. Finalmente, o ensaio colorimétrico pode ser baseado em cuvette ou adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. O presente trabalho fornece um protocolo bem estabelecido que é adequado para a detecção de alterações nos níveis de ferro tecidual em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro.
Introduction
O ferro é um micronutriente essencial, necessário para a função de proteínas envolvidas em processos biológicos cruciais, como transporte de oxigênio, produção de energia ou síntese de DNA. É importante ressaltar que tanto o excesso de ferro quanto a deficiência de ferro são altamente prejudiciais à saúde humana, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. Absorção anormal de ferro dietético, dietas deficientes de ferro, transfusões de sangue repetidas e inflamação crônica são causas comuns de distúrbios associados ao ferro que afetam bilhões de pessoas em todo o mundo1,2,3.
Modelos experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro têm sido fundamentais para avançar nosso conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase de ferro4. Apesar dos progressos substanciais feitos nas últimas duas décadas, muitos aspectos-chave permanecem evasivos. Nos próximos anos, a medição precisa dos níveis totais de ferro nos tecidos animais continuará sendo um passo crítico para avançar nas pesquisas no campo da biologia do ferro.
A maioria dos laboratórios quantifica o ferro tecidual com espectroscopia de absorção atômica (AAS), espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS), ou um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Este último é baseado no método original descrito por Torrance e Bothwell há mais de 50 anos, 5,6. Embora uma variação deste método tenha sido posteriormente desenvolvida empregando ferrozina como alternativa à batiphenanthrolina7, este último continua sendo o reagente cromogênico mais citado na literatura.
O método de escolha muitas vezes depende da expertise e infraestrutura disponíveis. Embora a AAS e a ICP-MS sejam mais sensíveis, o ensaio colorimétrico permanece amplamente utilizado porque apresenta as seguintes vantagens importantes: i) exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos; ii) não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros; e iii) o ensaio original baseado em cuvette pode ser adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. A abordagem colorimétrica apresentada neste trabalho é rotineiramente utilizada para quantificar alterações nos níveis de ferro não heme de tecido em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro, de roedores a peixes e moscas frutíferas. Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples, bem estabelecido, ensaio colorimétrico que a maioria dos laboratórios deve encontrar fácil de implementar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo para a medição do teor de ferro não-heme em tecidos animais é fornecido, utilizando uma adaptação do ensaio colorimétrico à base de banho-phenrodina originalmente descrito por Torrance e Bothwell5,6. As etapas críticas do método são a secagem da amostra de tecido; desnaturação proteica e liberação de ferro inorgânico por hidrólise ácida; redução do ferro férrico (Fe3+) ao estado ferroso (Fe2+) na presença d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Fundos Nacionais por meio da FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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