Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina
Summary
Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.
Abstract
Il ferro è un micronutriente essenziale. Sia il sovraccarico di ferro che la carenza sono altamente dannosi per l’uomo e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L’uso di modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro è stato determinante per far progredire la conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell’omeostasi del ferro. La misurazione dei livelli totali di ferro nei tessuti animali viene comunemente eseguita con la spettroscopia di assorbimento atomico o con un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Per molti anni, il saggio colorimetrico è stato utilizzato per la misurazione del contenuto di ferro non eme in una vasta gamma di tessuti animali. A differenza della spettroscopia di assorbimento atomico, esclude il contributo dell’eme ferro derivato dall’emoglobina contenuta nei globuli rossi. Inoltre, non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature molto costose e può quindi essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori. Infine, il test colorimetrico può essere basato su cuvette o adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. Il presente lavoro fornisce un protocollo ben consolidato che è adatto per la rilevazione di alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro.
Introduction
Il ferro è un micronutriente essenziale, necessario per la funzione delle proteine coinvolte in processi biologici cruciali come il trasporto di ossigeno, la produzione di energia o la sintesi del DNA. È importante sottolineare che sia l’eccesso di ferro che la carenza di ferro sono altamente dannosi per la salute umana e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L’assorbimento anormale del ferro nella dieta, le diete carenti di ferro, le ripetute trasfusioni di sangue e l’infiammazione cronica sono cause comuni di disturbi associati al ferro che colpiscono miliardi di persone in tutto il mondo1,2,3.
Modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro sono stati strumentali per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell’omeostasi del ferro4. Nonostante i sostanziali progressi compiuti negli ultimi due decenni, molti aspetti chiave rimangono sfuggenti. Nei prossimi anni, la misurazione accurata dei livelli totali di ferro nei tessuti animali rimarrà un passo fondamentale per far progredire la ricerca nel campo della biologia del ferro.
La maggior parte dei laboratori quantifica il ferro tissutale con la spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) o un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Quest’ultimo si basa sul metodo originale descritto da Torrance e Bothwell oltre 50 anni fa5,6. Mentre una variante di questo metodo è stata successivamente sviluppata utilizzando la ferrozina come alternativa alla bathofenantrolina7, quest’ultimo rimane il reagente cromogenico più ampiamente citato in letteratura.
Il metodo di scelta dipende spesso dalle competenze e dall’infrastruttura disponibili. Mentre AAS e ICP-MS sono più sensibili, il saggio colorimetrico rimane ampiamente utilizzato perché presenta i seguenti importanti vantaggi: i) esclude il contributo di ferro eme derivato dall’emoglobina contenuta nei globuli rossi; ii) non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature altamente costose; e iii) il saggio originale basato su cuvette può essere adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. L’approccio colorimetrico presentato in questo lavoro viene abitualmente utilizzato per quantificare le alterazioni nei livelli di ferro non eme tissutale in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro, dai roditori ai pesci e alla mosca della frutta. Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e ben consolidato che la maggior parte dei laboratori dovrebbe trovare facile da implementare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un adattamento del saggio colorimetrico basato sulla batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6. Le fasi critiche del metodo sono l’essiccazione del campione di tessuto; denaturazione proteica e rilascio di ferro inorganico per idrolisi acida; riduzione del ferro ferrico (Fe3+) allo stato ferroso (Fe2+) in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da Fondi Nazionali attraverso FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., nell’ambito del progetto UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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