Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay
Summary
Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk in de meeste laboratoria kan worden geïmplementeerd.
Abstract
IJzer is een essentiële micronutriënt. Zowel ijzerstapeling als tekort zijn zeer schadelijk voor de mens en het weefselijzergehalte wordt fijn gereguleerd. Het gebruik van experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -deficiëntie is van groot belang geweest voor het bevorderen van de kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase. De meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels wordt gewoonlijk uitgevoerd met atomaire absorptiespectroscopie of met een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantronlinereagens. Al vele jaren wordt de colorimetrische test gebruikt voor het meten van het niet-heemijzergehalte in een breed scala aan dierlijke weefsels. In tegenstelling tot atomaire absorptiespectroscopie, sluit het de bijdrage van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen uit. Bovendien vereist het geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan het dus gemakkelijk in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Ten slotte kan de colorimetrische test op cuvette-basis zijn of worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. Het huidige werk biedt een goed ingeburgerd protocol dat geschikt is voor de detectie van veranderingen in weefselijzerniveaus in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort.
Introduction
IJzer is een essentiële micronutriënt, die nodig is voor de functie van eiwitten die betrokken zijn bij cruciale biologische processen zoals zuurstoftransport, energieproductie of DNA-synthese. Belangrijk is dat zowel ijzeroverschot als ijzertekort zeer schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en dat weefselijzerniveaus nauwkeurig worden gereguleerd. Abnormale ijzerabsorptie via de voeding, ijzertekort, herhaalde bloedtransfusies en chronische ontsteking zijn veel voorkomende oorzaken van ijzergerelateerde aandoeningen die miljarden mensen wereldwijd treffen1,2,3.
Experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -tekort zijn instrumenteel geweest om onze kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase4 te bevorderen. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die de afgelopen twee decennia is geboekt, blijven veel belangrijke aspecten ongrijpbaar. In de komende jaren zal de nauwkeurige meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels een cruciale stap blijven om het onderzoek op het gebied van ijzerbiologie te bevorderen.
De meeste laboratoria kwantificeren weefselijzer met atomaire absorptiespectroscopie (AAS), inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS), of een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantrontrolinereagens. Dit laatste is gebaseerd op de oorspronkelijke methode beschreven door Torrance en Bothwell meer dan 50 jaar geleden5,6. Hoewel vervolgens een variant van deze methode werd ontwikkeld met ferrozine als alternatief voor bathofenanthroline7, blijft dit laatste het meest geciteerde chromogene reagens in de literatuur.
De gekozen methode is vaak afhankelijk van de beschikbare expertise en infrastructuur. Hoewel AAS en ICP-MS gevoeliger zijn, blijft de colorimetrische test veel gebruikt omdat het de volgende belangrijke voordelen biedt: i) het sluit de bijdrage uit van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen; ii) het vereist geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur; en iii) de oorspronkelijke test op basis van cuvette kan worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. De colorimetrische benadering die in dit werk wordt gepresenteerd, wordt routinematig gebruikt om veranderingen in weefsel niet-heemijzerniveaus te kwantificeren in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort, van knaagdieren tot vissen en fruitvlieg. Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde, colorimetrische test die de meeste laboratoria gemakkelijk te implementeren zouden moeten vinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels wordt verstrekt, met behulp van een aanpassing van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test die oorspronkelijk werd beschreven door Torrance en Bothwell5,6. De kritische stappen van de methode zijn het drogen van weefselmonsters; eiwitdenaturatie en afgifte van anorganisch ijzer door zure hydrolyse; reductie van ijzer (Fe3 +) tot de ijzertoestand (Fe2 +…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door nationale fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., in het kader van het project UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
