Mesure de la teneur en fer non hémique des tissus à l’aide d’un test colorimétrique à base de bathophénanthroline
Summary
Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires.
Abstract
Le fer est un micronutriment essentiel. La surcharge et la carence en fer sont très préjudiciables aux humains, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’utilisation de modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer a été déterminante pour faire progresser les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer. La mesure des niveaux de fer total dans les tissus animaux est généralement effectuée par spectroscopie d’absorption atomique ou avec un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophénanthroline. Depuis de nombreuses années, le test colorimétrique est utilisé pour mesurer la teneur en fer non hémique dans un large éventail de tissus animaux. Contrairement à la spectroscopie d’absorption atomique, elle exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges. De plus, il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipements très coûteux, et peut donc être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Enfin, le test colorimétrique peut être basé sur une cuvette ou adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. Le présent travail fournit un protocole bien établi qui convient à la détection d’altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer.
Introduction
Le fer est un micronutriment essentiel, nécessaire à la fonction des protéines impliquées dans des processus biologiques cruciaux tels que le transport de l’oxygène, la production d’énergie ou la synthèse de l’ADN. Il est important de noter que l’excès de fer et la carence en fer sont très préjudiciables à la santé humaine, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’absorption anormale du fer alimentaire, les régimes alimentaires déficients en fer, les transfusions sanguines répétées et l’inflammation chronique sont des causes courantes de troubles associés au fer qui affectent des milliards de personnes dans le monde1,2,3.
Des modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer ont joué un rôle déterminant dans la progression de nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer4. Malgré les progrès substantiels réalisés au cours des deux dernières décennies, de nombreux aspects clés restent insaisissables. Dans les années à venir, la mesure précise des niveaux totaux de fer dans les tissus animaux restera une étape cruciale pour faire progresser la recherche dans le domaine de la biologie du fer.
La plupart des laboratoires quantifient le fer tissulaire avec la spectroscopie d’absorption atomique (SAA), la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophtrophrolique. Ce dernier est basé sur la méthode originale décrite par Torrance et Bothwell il y a plus de 50 ans5,6. Bien qu’une variante de cette méthode ait ensuite été développée en utilisant la ferrozine comme alternative à la bathophénanthroline7, cette dernière reste le réactif chromogène le plus largement cité dans la littérature.
La méthode de choix dépend souvent de l’expertise et de l’infrastructure disponibles. Bien que l’AAS et l’ICP-MS soient plus sensibles, le test colorimétrique reste largement utilisé car il présente les avantages importants suivants: i) il exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges; ii) il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipement très coûteux; et iii) le test original à base de cuvette peut être adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. L’approche colorimétrique présentée dans ce travail est couramment utilisée pour quantifier les altérations des niveaux de fer non hémique dans les tissus dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer, des rongeurs aux poissons et à la mouche des fruits. Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi que la plupart des laboratoires devraient trouver facile à mettre en œuvre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant une adaptation du dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et Bothwell5,6. Les étapes critiques de la méthode sont le séchage des échantillons de tissus; dénaturation des protéines et libération de fer inorganique par hydrolyse acide; réduction du fer ferrique (Fe3+) à l’état ferreux…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des fonds nationaux par l’intermédiaire de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., dans le cadre du projet UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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