מדידה של תוכן ברזל רקמות שאינן Heme באמצעות בדיקת צבע מבוססת Bathophenanthroline
Summary
כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת היטב שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות.
Abstract
ברזל הוא מיקרו-תזונה חיונית. הן עומס יתר בברזל והן מחסור מזיקים מאוד לבני אדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. השימוש במודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר או מחסור בברזל היה אינסטרומנטלי לקידום הידע של המנגנונים המעורבים בוויסות המערכתי והתאי של הומאוסטזיס ברזל. המדידה של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים מבוצעת בדרך כלל עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית או עם בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט bathophenanthroline. במשך שנים רבות, הבדיקה הצבעונית שימשה למדידת תכולת הברזל שאינה heme במגוון רחב של רקמות בעלי חיים. שלא כמו ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית, זה לא כולל את התרומה של ברזל heme נגזר המוגלובין הכלול בתאי דם אדומים. יתר על כן, זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד, ולכן ניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות. לבסוף, הבדיקה הצבעונית יכולה להיות מבוססת קוביט או מותאמת לתבנית מיקרו-לוחית, המאפשרת תפוקת דגימה גבוהה יותר. העבודה הנוכחית מספקת פרוטוקול מבוסס היטב המתאים לגילוי שינויים ברמות הברזל ברקמות במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל.
Introduction
ברזל הוא מיקרונוטריאנט חיוני, הנדרש לתפקוד חלבונים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חיוניים כגון הובלת חמצן, ייצור אנרגיה או סינתזת DNA. חשוב לציין, הן עודף ברזל והן מחסור בברזל מזיקים מאוד לבריאות האדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. ספיגת ברזל תזונתית חריגה, דיאטות לקויות ברזל, עירויי דם חוזרים ונשנים ודלקת כרונית הם גורמים נפוצים להפרעות הקשורות לברזל המשפיעות על מיליארדי אנשים ברחבי העולם1,2,3.
מודלים בעלי חיים ניסיוניים של עומס יתר בברזל או מחסור היו אינסטרומנטליים כדי לקדם את הידע שלנו על המנגנונים המעורבים ברגולציה המערכתית והתאית של הומאוסטזיס ברזל4. למרות ההתקדמות המשמעותית שחלה בשני העשורים האחרונים, היבטים מרכזיים רבים נותרו חמקמקים. בשנים הקרובות, המדידה המדויקת של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים תישאר צעד קריטי לקידום המחקר בתחום הביולוגיה של הברזל.
רוב המעבדות מכמתות ברזל רקמה עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית (AAS), ספקטרומטר מסה פלזמה מצמידה אינדוקטיבית (ICP-MS), או בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט רחצה-אנתרופתרולין. זה האחרון מבוסס על השיטה המקורית שתוארה על ידי טורנס ובותוול לפני יותר מ -50 שנה. בעוד וריאציה של שיטה זו פותחה לאחר מכן באמצעות פרוזין כחלופה bathophenanthroline7, האחרון נשאר ריאגנט הכרומוגני הנפוץ ביותר בספרות.
שיטת הבחירה תלויה לעתים קרובות במומחיות ובתשתית הזמינה. בעוד AAS ו- ICP-MS רגישים יותר, הבדיקה הצבעונית נשארת בשימוש נרחב מכיוון שהיא מציגה את היתרונות החשובים הבאים: i) היא אינה כוללת את תרומתו של ברזל heme הנגזר מהמוגלובין הכלול בתאי דם אדומים; ii) זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד; ו-iii) ניתן להתאים את הבדיקה המקורית המבוססת על קוביט לפורמט מיקרו-לוחית, המאפשר תפוקת מדגם גבוהה יותר. הגישה הצבעונית המוצגת בעבודה זו משמשת באופן שגרתי לכימות שינויים ברמות הברזל של הרקמה שאינה heme במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל, מכרסמים לדגים ולעוף פירות. כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה פשוטה, מבוססת היטב, צבעונית כי רוב המעבדות צריך למצוא קל ליישם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול למדידת תכולת הברזל שאינה heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות התאמה של בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline שתואר במקור על ידי טורנס ו Bothwell5,6. השלבים הקריטיים של השיטה הם ייבוש דגימת רקמות; denaturation חלבון ושחרור של ברזל אנאורגני על ידי הידרוליזה חומצה; הפחתה של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., תחת הפרויקט UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
