本文提供了一种利用简单且成熟的比色法测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，该方法可在大多数实验室中轻松实施。
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本文内容
摘要
摘要
铁是一种必需的微量营养素。铁过载和铁缺乏均对人体有严重危害，机体组织中的铁水平受到精密调控。利用铁过载或铁缺乏的实验动物模型，对于深入理解系统性和细胞水平铁稳态调控机制起到了关键作用。动物组织总铁含量的测定通常采用原子吸收光谱法，或基于非血红素铁与浴菲咯啉试剂反应的比色法。多年来，比色法已被广泛用于多种动物组织中非血红素铁含量的测定。与原子吸收光谱法不同，该方法可排除红细胞中血红蛋白所含血红素铁的干扰。此外，该方法无需复杂的分析技术或昂贵的仪器设备，因此可在大多数实验室中便捷实施。最后，比色法既可采用比色皿法，也可适配于微孔板格式，从而实现更高通量的样本检测。本文提供了一种成熟可靠的实验方案，适用于多种铁过载或铁缺乏实验动物模型中组织铁水平变化的检测。
引言
铁是一种必需的微量营养素，是参与氧气运输、能量生成和DNA合成等关键生物过程的蛋白质发挥功能所必需的。重要的是，铁过量和铁缺乏均对人体健康造成严重危害，机体组织中的铁水平受到精密调控。异常的膳食铁吸收、缺铁饮食、反复输血以及慢性炎症是全球数十亿人铁相关疾病常见的病因1,2,3。
铁过载或铁缺乏的实验动物模型在推动我们理解系统性和细胞水平铁稳态调控机制方面发挥了重要作用4。尽管过去二十年取得了显著进展，但仍有许多关键方面尚不明确。在未来几年中，准确测定动物组织中的总铁含量仍将是推进铁生物学领域研究的关键步骤。
大多数实验室采用原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）或基于非血红素铁与邻二氮杂菲试剂显色反应的比色法来定量组织中的铁含量。后者基于Torrance和Bothwell在50多年前首次描述的方法5,6。尽管此后有研究开发了以菲啰嗪替代邻二氮杂菲的改进方法7，但邻二氮杂菲仍是文献中引用最广泛的显色试剂....
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方案
C57BL/6 小鼠购自商业渠道，铁调素缺失（hepcidin-null）（Hamp1−/−) C57BL/6 背景小鼠8 由 Sophie Vaulont（法国科钦研究所）惠赠。动物饲养于 i3S 动物设施中，环境温度与光照受控，饲养条件为无特定病原体，可自由获取标准啮齿类饲料和水。欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax从一家商业渔场购买，并饲养于ICBAS动物实验设施中，环境温度与光照条件受控，每日喂食 随意 使用标准海鲈鱼饲料喂养。所有涉及脊椎动物的实验程序均经i3S动物伦理委员会及国家主管部门Direção-Geral de Alimentação e Veterinária（DGAV）批准。有关商用试剂、设备和动物的信息列于下文 材料清单.
1. 溶液配制
注意：使用无铁玻璃器皿或一次性塑料器皿处理和配制所有试剂与溶液。避免金属实验材料（例如不锈钢刮勺）接触任何试剂或溶液，以防铁污染。确保所有可重复使用的玻璃器皿均不含铁。将器皿用适当的实验室洗涤剂清洗 30–60 分钟，用去离子水冲洗，再在用去离子水按 1:3 稀释的 37% 硝酸溶液中浸泡过夜，然后再次用去离子水冲洗，并使其自然晾干。
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结果
比色皿与96孔微孔板的比较
通过Torrance和Bothwell最初描述的邻菲罗啉试剂反应测定组织非血红素铁含量的方法5,6，依赖于分光光度计进行吸光度读数。因此，显色反应所用体积需与常规分光光度计比色皿的尺寸相匹配。本研究描述了一种方法学改进，即将显色反应直接在96孔微孔板中进行，并使用微孔板读板仪测定吸光度，从而减少试剂用量并提高检测通量。
为比较两种方法的灵敏度，首先配制工作铁标准溶液（WISS）的系列稀释液，并根据指示在1.5 mL离心管或96孔板中进行显色反应。 表 2吸光度分别使用分光光度计（带比色皿）或微孔板读板仪进行测定。两种方法生成的代表性标准曲线如图所示。 图1A. 在两种情况下，线性度均非常高（r2 = 0.9996 且 r2 分别为微孔板和比色皿在所测试的铁浓度范.......
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讨论
本文提供了一种测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，该方法基于Torrance和Bothwell最初描述的邻菲罗啉比色法5,6，并进行了适当改进。该方法的关键步骤包括：组织样本的干燥；通过酸水解使蛋白质变性并释放无机铁；在还原剂巯基乙酸存在下，将三价铁（Fe3+）还原为二价亚铁状态（Fe2+），随后与邻菲罗啉试剂发生显色反应（生色反应）；测定生成的亚铁离子-邻菲罗啉粉红色复合物的吸光度；最后计算组织中的铁含量。
本研究展示了如何将原有的比色皿法方案改进为基于96孔板的高通量形式，同时不降低检测的灵敏度。值得注意的是，这种改进可显著节省时间，原因如下：1）利用多通道移液器可在96孔板中同时制备更多的显色反应；2）使用酶标仪读取吸光度的速度远快于分光光度计。基于微孔板的检测另一重要优势在于可调整显色反应的体积，从而显著降低试剂成本（尤其是邻菲罗啉试剂）。整个实验流程可在4天内完成。样品干燥（在65 °C烘箱中进行时最长可达4.......
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致谢
本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.）通过项目编号 UIDB/04293/2020 的国家基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔紫外透明板 | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| 分析天平 | Kern | ABJ 220-4M | |
| 无水乙酸钠 | Merck | 106268 | |
| 邻菲罗啉二磺酸钠（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸） | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 小鼠（Mus musculus） | Charles River Laboratories | ||
| 羰基铁粉，≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）一次性比色皿 | VWR | 634-0678P | |
| 双蒸灭菌水 | B. Braun | 0082479E | |
| 荧光酶标仪 | BioTek Instruments | FLx800 | |
| 盐酸，37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| 微波消解炉及白色聚四氟乙烯消解杯 | CEM | MDS-2000 | |
| 硝酸 | Fisher Scientific | 15687290 | |
| 烘箱 | Binder | ED115 | |
| 啮齿类动物饲料 | Harlan Laboratories | 2014S | 含铁量为 175 mg/kg 的 Teklad Global 14% 蛋白啮齿类维持饲料 |
| 海鲈鱼（Dicentrarchus labrax） | Sonrionansa | ||
| 海鲈鱼饲料 | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| 单光束紫外-可见分光光度计 | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| 巯基乙酸 | Merck | 100700 | |
| 三氯乙酸 | Merck | 100807 |
参考文献
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
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重印与许可
