Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정
Summary
여기서, 동물 조직에서 헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 간단하고 잘 확립된 비색 분석법을 사용한다.
Abstract
철분은 필수 미량 영양소입니다. 철분 과부하와 결핍 모두 인간에게 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절됩니다. 철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델의 사용은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다. 동물 조직에서 총 철 수준의 측정은 일반적으로 원자 흡수 분광법 또는 비 헴철과 바토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석으로 수행됩니다. 수년 동안, 비색 분석은 광범위한 동물 조직에서 비헴철 함량의 측정에 사용되어 왔다. 원자 흡수 분광법과는 달리, 적혈구에 포함 된 헤모글로빈에서 유래 한 헴철의 기여를 배제합니다. 또한 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으므로 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 비색 분석은 큐벳 기반이거나 마이크로플레이트 형식에 맞게 조정될 수 있으므로 더 높은 샘플 처리량이 가능합니다. 본 연구는 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철분 수준의 변화를 검출하는데 적합한 잘 확립된 프로토콜을 제공한다.
Introduction
철분은 산소 수송, 에너지 생산 또는 DNA 합성과 같은 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 기능에 필요한 필수 미량 영양소입니다. 중요한 것은 철분 과잉과 철분 결핍 모두 인체 건강에 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절된다는 것입니다. 비정상적인식이 철분 흡수, 철분 결핍식이 요법, 반복적 인 수혈 및 만성 염증은 전 세계 수십억 명의 사람들에게 영향을 미치는 철분 관련 장애의 일반적인 원인입니다1,2,3.
철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다4. 지난 이십 년 동안 이루어진 상당한 진전에도 불구하고, 많은 주요 측면은 여전히 애매하다. 앞으로 몇 년 동안 동물 조직의 총 철분 수준을 정확하게 측정하는 것은 철 생물학 분야의 연구를 발전시키는 중요한 단계로 남아있을 것입니다.
대부분의 실험실은 원자 흡수 분광법 (AAS), 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS) 또는 비 헴철과 바스토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석법으로 조직 철분을 정량화합니다. 후자는 50 년 전에 Torrance와 Bothwell이 묘사 한 원래의 방법을 기반으로합니다.5,6. 이 방법의 변형이 바스토페난트롤린7의 대안으로 페로진을 사용하여 개발되었지만, 후자는 문헌에서 가장 널리 인용 된 발색 시약으로 남아 있습니다.
선택 방법은 종종 사용 가능한 전문 지식과 인프라에 달려 있습니다. AAS 및 ICP-MS가 더 민감하지만, 비색 분석은 다음과 같은 중요한 이점을 제시하기 때문에 널리 사용되고 있습니다 : i) 적혈구에 포함 된 헤모글로빈으로부터 유래 된 헴철의 기여를 배제합니다. ii) 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않습니다. iii) 원래의 큐벳-기반 분석은 마이크로플레이트 포맷에 적응될 수 있고, 더 높은 샘플 처리량을 허용한다. 이 연구에서 제시된 비색 접근법은 설치류에서 물고기 및 초파리에 이르기까지 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 비 헴 철분 수준의 변화를 정량화하는 데 일상적으로 사용됩니다. 여기서, 동물 조직에서 비헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 구현하기 쉬운 단순하고 잘 확립된 비색 분석을 사용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동물 조직에서 헴철 함량의 측정을 위한 프로토콜이 제공되며, 원래 Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 기술된 바토페난트롤린-기반 비색 분석법의 적응을 이용한다. 상기 방법의 중요한 단계는 조직 샘플 건조; 단백질 변성 및 산 가수분해에 의한 무기 철의 방출; 환원제 티오글리콜산의 존재 하에 철(Fe3+)철을 철 상태(Fe2+)로 환원시키고, 바토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 UIDB/04293/2020 프로젝트에 따라 FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.를 통해 National Fund가 자금을 지원했습니다.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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