使用基于菲咯啉的比色法测量组织非血红素铁含量

Summary

在这里，提供了一种测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用一种简单，成熟的比色法，可以在大多数实验室中轻松实施。

Abstract

铁是一种必需的微量营养素。铁超负荷和缺乏都对人类非常有害，组织铁水平受到精细调节。铁超负荷或缺乏的实验动物模型的使用有助于提高铁稳态的全身和细胞调节机制的知识。动物组织中总铁水平的测量通常使用原子吸收光谱或基于非血红素铁与菲罗啉试剂反应的比色测定进行。多年来，比色测定法一直用于测量各种动物组织中的非血红素铁含量。与原子吸收光谱不同，它排除了来自红细胞中含有的血红蛋白的血红素铁的贡献。此外，它不需要复杂的分析技能或昂贵的设备，因此可以在大多数实验室中轻松实施。最后，比色法可以基于比色皿，也可以适应微孔板形式，从而实现更高的样品通量。本工作提供了一个完善的方案，适用于检测铁超载或缺铁的各种实验动物模型中组织铁水平的改变。

Introduction

铁是一种必需的微量营养素，是参与关键生物过程（如氧气运输、能量产生或DNA合成）的蛋白质功能所必需的。重要的是，铁过量和缺铁都对人体健康非常有害，组织铁水平受到精细调节。饮食中铁吸收异常、缺铁饮食、反复输血和慢性炎症是影响全球数十亿人的铁相关疾病的常见原因^1，2，3。

铁超负荷或缺乏的实验动物模型有助于提高我们对铁稳态的全身和细胞调节机制的了解⁴。尽管在过去二十年中取得了重大进展，但许多关键方面仍然难以捉摸。在未来几年，准确测量动物组织中的总铁水平仍将是推进铁生物学领域研究的关键一步。

大多数实验室使用原子吸收光谱（AAS），电感耦合血浆质谱（ICP-MS）或基于非血红素铁与菲螺母试剂反应的比色测定来定量组织铁。后者基于Torrance和Bothwell在50多年前描述的原始方法^5，6。虽然随后开发了该方法的变体，采用亚铁嗪作为菲咯啉^{的替代品7}，但后者仍然是文献中引用最广泛的显色试剂。

Protocol

C57BL / 6小鼠是商业购买的，C57BL / 6背景上的铁调素空（Hamp1^−/−）小鼠⁸ 是Sophie Vaulont（法国科钦研究所）的善意礼物。动物被安置在i3S动物设施中，在特定的无病原体条件下，在温度和光线受控的环境中，可以自由获取标准的啮齿动物食物和水。欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）是从一个商业养鱼场购买的，饲养在ICBAS动物设施中，在温度和光线受控的环境中，每天用标准鲈鱼饲料 随意 喂养。所有涉及脊椎动物的程序均由i3S动物伦理委员会和国家当局Direcão-Geral de Alimentação e Veterinária（DGAV）批准。有关商业试剂、设备和动物的信息列在 材料表中。

1. 溶液制备

注意:使用无铁玻璃器皿或一次性塑料器皿处理并准备所有试剂和溶液。由于存在铁污染的风险，不要让金属实验室材料（例如不锈钢刮刀）与任何试剂或溶液接触。确保任何可重复使用的玻璃器皿都是无铁的。用适当的实验室洗涤剂洗涤材料30-60分钟，用去离子水冲洗，在用去离子水以1:3稀释的37%硝酸溶液中浸泡过夜，用去离子水再次冲洗，然后晾干。

1. 酸混合物:在玻璃瓶中加入10克三氯乙酸....

Results

比色皿与 96 孔微孔板比较
通过与最初由Torrance和Botthwell5^，6描述的菲咯啉试剂反应测量组织非血红素铁依赖于使用分光光度计进行吸光度读数。因此，染色原反应中使用的体积与常规分光光度计比色皿的大小相容。本工作描述了一种方法适应性，其中染色原反应直接在96孔微孔板中制备，用于在酶标仪中测量吸光度，需要更小的试剂体积并允许更高的通量。

为了比较两种方法的灵敏度，最初制备了工作铁标准溶液（WISS）的连续稀释，并将染色原反应组装在1.5mL管或96孔板中，如表2所示。吸光度分别在分光光度计（带比色皿）或酶标仪中测量。使用这两种方法生成的代表性标准曲线如图1A所示。在这两种情况下，测试铁浓度的线性度都非常高（微孔板和比色皿的线性度分别为r2 = 0.9996和^r2 = 0.9997.......

Discussion

提供了测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用最初由Torrance和Bothwell描述的基于菲罗啉的比色测定法的适应性^5，6。该方法的关键步骤是组织样品干燥;蛋白质变性并通过酸水解释放无机铁;在还原剂硫代乙醇酸存在下将铁（^{Fe3 +}）还原为亚铁状态（^{Fe2 +}），并将其与菲咯啉试剂反应（染色原反应）;所得黑色离子/菲咯啉粉红色复合物的吸光度读数;和组织铁含量的计算。

目前的工作表明，基于比色皿的原始方案如何适应基于96孔的格式，从而在不影响测定灵敏度的情况下实现更高的通量。值得注意的是，这种适应性可以节省大量时间，因为:1）使用多通道移液器可以在96孔板中同时制备更多的染色原反应;2）读板器中的吸光度读数比使用分光光度计时快得多。基于微孔板的测定的另一个重要优点是调整了发色剂反应体积，这大大降低了试剂（特别是使用菲洛啉试剂）的成本。整个协议可以在4天内完成。样品干燥（在65°C的烤箱中进行时可能需要长达48小时）和酸性.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96孔紫外透明板	Sarstedt	82.1581.001
分析天平	Kern	ABJ 220-4M
无水乙酸钠	Merck	106268
巴索菲咯啉磺酸盐（4,7-二苯基-1,10-菲啉二磺酸）	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL / 6小鼠（Mus musculus< / em>）	Charles River Laboratories
羰基铁粉，≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 一次性比色	VWR	634-0678P
双蒸无菌水	B. Braun	0082479E
荧光酶标仪	BioTek Instruments	FLx800
盐酸，37%	Sigma-Aldrich	258148
微波消化炉和白色特氟龙杯	CEM	MDS-2000
硝酸	Fisher Scientific	15687290
炉	粘合剂	ED115
啮齿动物食物	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% 蛋白质啮齿动物维持饮食，含有 175 毫克/千克铁
鲈鱼 （Dicentrarchus labrax）	Sonrionansa
海鲈鱼饲料	Skretting	L-2 Alterna 1P
单光束紫外-可见分光光度计	岛津	UV mini 1240
巯基乙酸	默克	100700
三氯乙酸	默	100807