Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina
Summary
Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.
Abstract
El hierro es un micronutriente esencial. Tanto la sobrecarga como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para los seres humanos, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. El uso de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro ha sido fundamental para avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro. La medición de los niveles totales de hierro en tejidos animales se realiza comúnmente con espectroscopia de absorción atómica o con un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenolantrolina. Durante muchos años, el ensayo colorimétrico se ha utilizado para la medición del contenido de hierro no hemo en una amplia gama de tejidos animales. A diferencia de la espectroscopia de absorción atómica, excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos. Además, no requiere habilidades analíticas sofisticadas ni equipos altamente costosos, y por lo tanto se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Finalmente, el ensayo colorimétrico puede basarse en cubetas o adaptarse a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El presente trabajo proporciona un protocolo bien establecido que es adecuado para la detección de alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro.
Introduction
El hierro es un micronutriente esencial, necesario para la función de las proteínas involucradas en procesos biológicos cruciales como el transporte de oxígeno, la producción de energía o la síntesis de ADN. Es importante destacar que tanto el exceso de hierro como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para la salud humana, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. La absorción anormal de hierro en la dieta, las dietas deficientes en hierro, las transfusiones de sangre repetidas y la inflamación crónica son causas comunes de trastornos asociados con el hierro que afectan a miles de millones de personas en todo el mundo1,2,3.
Los modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro han sido fundamentales para avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro4. A pesar de los progresos sustanciales realizados durante las dos últimas décadas, muchos aspectos clave siguen siendo difíciles de alcanzar. En los próximos años, la medición precisa de los niveles totales de hierro en los tejidos animales seguirá siendo un paso crítico para avanzar en la investigación en el campo de la biología del hierro.
La mayoría de los laboratorios cuantifican el hierro tisular con espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS) o un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenantrolina. Este último se basa en el método original descrito por Torrance y Bothwell hace más de 50 años5,6. Si bien posteriormente se desarrolló una variación de este método empleando ferrozina como alternativa a la batofenantrolina7, este último sigue siendo el reactivo cromogénico más citado en la literatura.
El método de elección a menudo depende de la experiencia y la infraestructura disponibles. Si bien AAS e ICP-MS son más sensibles, el ensayo colorimétrico sigue siendo ampliamente utilizado porque presenta las siguientes ventajas importantes: i) excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos; ii) no requiere habilidades analíticas sofisticadas o equipos altamente costosos; y iii) el ensayo original basado en cubeta se puede adaptar a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El enfoque colorimétrico presentado en este trabajo se utiliza rutinariamente para cuantificar alteraciones en los niveles de hierro no hemo tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro, desde roedores hasta peces y moscas de la fruta. Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en los tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple, bien establecido que la mayoría de los laboratorios deberían encontrar fácil de implementar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando una adaptación del ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6. Los pasos críticos del método son el secado de muestras de tejido; desnaturalización de proteínas y liberación de hierro inorgánico por hidrólisis ácida; reducción del hierro férrico (Fe3+) al estado ferroso (Fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por fondos nacionales a través de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., en el marco del proyecto UIDB/04293/2020.
Materials
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. Tissue iron stores. Methods in Haematology. , 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
