تقييم استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج العالمي باستخدام وسم الحمض النووي BrdU إلى جانب تصوير تمييز دورة الخلية
Summary
في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.
Abstract
تعد دراسة الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) مجالا معقدا وأساسيا ، والذي أصبح أكثر أهمية فقط بسبب استخدام الأدوية التي تستهدف DDR لعلاج السرطان. هذه الأهداف هي البوليميراز البولي (ADP-ribose) (PARPs) ، والتي تبدأ أشكالا مختلفة من إصلاح الحمض النووي. إن تثبيط هذه الإنزيمات باستخدام مثبطات PARP (PARPi) يحقق الفتك الاصطناعي من خلال منح ضعف علاجي في الخلايا التي تعاني من نقص في إعادة التركيب المتماثل (HR) بسبب الطفرات في سرطان الثدي من النوع 1 (BRCA1) أو BRCA2 أو شريك وتوطين BRCA2 (PALB2).
الخلايا المعالجة ب PARPi تتراكم فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط (DSBs). تتم معالجة هذه الفواصل بواسطة آلية استئصال نهاية الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تكوين الحمض النووي الأحادي (SS) وإصلاح الحمض النووي اللاحق. في سياق BRCA1 الناقص ، يؤدي تنشيط استئصال الحمض النووي من خلال الطفرات في مثبطات استئصال الحمض النووي ، مثل 53BP1 و DYNLL1 ، إلى مقاومة PARPi. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة استئصال الحمض النووي في السيلولو أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي وتطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على مقاومة PARPi. تسمح التقنيات القائمة على التألق المناعي (IF) بمراقبة استئصال الحمض النووي العالمي بعد تلف الحمض النووي. تتطلب هذه الاستراتيجية وضع علامات الحمض النووي الجينومي طويل النبض باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). بعد تلف الحمض النووي واستئصال نهاية الحمض النووي ، يتم الكشف عن الحمض النووي الناتج الذي تقطعت به السبل على وجه التحديد بواسطة جسم مضاد مضاد ل BrdU في ظل ظروف أصلية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة استئصال الحمض النووي باستخدام علامات دورة الخلية للتمييز بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. تسمح الخلايا في مرحلة S / G2 بدراسة الاستئصال النهائي داخل HR ، في حين يمكن استخدام خلايا G1 لدراسة الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). يتم وصف بروتوكول مفصل لطريقة IF هذه إلى جانب التمييز في دورة الخلية في هذه الورقة.
Introduction
يعد تعديل عوامل إصلاح الحمض النووي طريقة دائمة التطور لعلاج السرطان ، خاصة في بيئات الأورام التي تعاني من نقص في إصلاح الحمض النووي. يعد تثبيط عوامل إصلاح محددة أحد الاستراتيجيات البارعة المستخدمة لتوعية الخلايا السرطانية بالعوامل الضارة بالحمض النووي. أدت عقود من الأبحاث إلى تحديد طفرات مختلفة من جينات إصلاح الحمض النووي كمؤشرات حيوية لخيارات الاستراتيجية العلاجية1. ونتيجة لذلك، أصبح مجال إصلاح الحمض النووي مركزا لتطوير الأدوية لضمان مجموعة واسعة من العلاجات، وتمكين مفهوم الطب الشخصي.
يتم إصلاح DSBs من خلال مسارين رئيسيين: NHEJ و HR2. مسار NHEJ عرضة للخطأ ، حيث يربط بسرعة نهايتين من الحمض النووي مع القليل من المعالجة النهائية للحمض النووي أو لا يوجد على الإطلاق ويتضمن بروتين كيناز (DNA-PKcs) ، ومركب Ku70/80 ، و 53BP1 ، وبروتينات RIF1 3. في المقابل ، الموارد البشرية هي آلية مخلصة بدأتها BRCA14. خطوة أساسية في إصلاح الموارد البشرية هي عملية استئصال نهاية الحمض النووي ، وهي تدهور النهايات المكسورة مما يؤدي إلى الحمض النووي الأحادي (SS) مع نهايات 3′-OH. يسهل BRCA1 توظيف البروتينات النهائية التي تشكل MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 ، والتي تشارك في استئصال الحمض النووي من 5 إلى 3 أقدام5.
يتم إنجاز الاستئصال النهائي الأولي من خلال نشاط endonuclease لل MRE11 ، مما يسمح بمزيد من المعالجة بواسطة nucleases DNA2 و EXO1. يتم طلاء بقايا ssDNA المتولدة بسرعة بواسطة بروتين النسخ المتماثل A (RPA) لحمايتها من المعالجة الإضافية. بعد ذلك ، تشارك BRCA2 و PALB2 و BRCA1 في التوسط في إزاحة RPA وتجميع نواة RAD51 المطلوبة لآلية الإصلاح الموجهة بالتماثل. من الضروري وجود توازن دقيق بين استخدام NHEJ والموارد البشرية للحفاظ الأمثل على السلامة الجينومية. يعتمد اختيار المسار على مرحلة دورة الخلية. يتم استخدام الموارد البشرية بشكل تفضيلي خلال المراحل من S إلى G2 حيث يكون استئصال الحمض النووي على أعلى مستوى ، وتتوفر الكروماتيدات الشقيقة لضمان الإصلاح المناسب.
بوليميراز بولي (ADP-ribose) 1 (PARP-1) هو واحد من أوائل البروتينات التي تم تجنيدها في DSB. وهو ينظم كل من نشاط الاستئصال وتجميع المؤثرات النهائية المشاركة في NHEJ5,6. مطلوب PARP-1 أيضا لإصلاح كسر الحمض النووي أحادي الخيط أثناء النسخ المتماثل7,8. نظرا لدورها المهم في إصلاح الحمض النووي ، يتم استخدام مثبطات PARP (PARPi) كعلاجات للسرطان. في العديد من أنواع السرطان التي تعاني من نقص الموارد البشرية ، يؤدي علاج PARPi إلى استجابة قاتلة اصطناعية بسبب عجز الخلايا التي تعاني من نقص الموارد البشرية عن إصلاح الضرر المتراكم عبر مسار بديل9,10. يوجد حاليا أربعة PARPi معتمدين من إدارة الأغذية والعقاقير: أولاباريب ، روكاباريب ، نيريباريب ، وتالازوباريب (وتسمى أيضا BMN 673) ، والتي تستخدم لمختلف علاجات سرطان الثدي والمبيض11. ومع ذلك ، فإن مقاومة PARPi شائعة ، وينشأ أحد الأسباب المحتملة من خلال استعادة كفاءة الموارد البشرية 12. فقدان أو تثبيط PARP-1 في وجود خلل التشعيع ينظم آلية الاستئصال ، مما يؤدي إلى تراكم مساحات ssDNA أطول13. لذلك ، فإن إجراء دراسة متعمقة لاستئصال الحمض النووي في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي والتطوير اللاحق لاستراتيجيات جديدة لعلاج السرطان والتغلب على مقاومة PARPi.
كانت هناك عدة طرق مستخدمة للكشف عن أحداث استئصال الحمض النووي5. إحدى هذه الطرق هي التقنية الكلاسيكية القائمة على IF التي تسمح بالتلطيخ غير المباشر وتصور الحمض النووي المستأصل بعد DSB الناجم عن الإجهاد باستخدام جسم مضاد مضاد ل RPA. إن وضع العلامات على الحمض النووي الجيني باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) والكشف عن ssDNA فقط هو قياس مباشر لأحداث استئصال الحمض النووي. إنه يتحايل على مراقبة RPA ، التي تشارك في عمليات خلوية متعددة مثل تكرار الحمض النووي. في الطريقة الموضحة هنا ، تسمح الخلايا المحتضنة ب BrdU لدورة خلية واحدة بدمج BrdU في خيط واحد من الحمض النووي الخلوي المكرر. بعد الاستئصال ، يتم إجراء تلطيخ IF في ظل ظروف تسمح باكتشاف BrdU فقط في شكل ssDNA ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل BrdU. يمكن لهذا الجسم المضاد الوصول فقط إلى نيوكليوتيدات BrdU المكشوفة ولن يكتشف تلك المدمجة في الحمض النووي المزدوج العالق. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن تصور الحمض النووي المقطوع في شكل بؤر BrdU / ssDNA مثقوبة. يمكن استخدام الكثافة النووية لهذه البؤر كقراءة لتحديد كمية الاستئصال بعد تلف الحمض النووي. تصف هذه الورقة خطوة بخطوة عمليات هذه الطريقة ، والتي يمكن تطبيقها على معظم خطوط خلايا الثدييات. يجب أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة واسعة كطريقة بسيطة لمراقبة استئصال نهاية الحمض النووي في السليلولو ، كدليل على المفهوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة طريقة تستخدم تلطيخ IF لقياس الاختلافات في استئصال الحمض النووي في السليلولو. المعيار الحالي لمراقبة تأثير على استئصال الحمض النووي هو من خلال تلطيخ RPA. ومع ذلك ، هذه طريقة غير مباشرة قد تتأثر بتكرار الحمض النووي. في السابق ، تم وصف تقنية أخرى لاستئصال الحمض النووي القائم …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماري كريستين كارون على المشورة الفنية المتميزة. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. يحمل كرسي أبحاث كندا من المستوى 1 في إصلاح الحمض النووي وعلاجات السرطان. J.O’S هو زميل طالب دكتوراه FRQS ، و S.Y.M هو زميل ما بعد الدكتوراه FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
