Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire
Summary
Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.
Abstract
L’étude de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) est un domaine complexe et essentiel, qui n’a fait que devenir plus important en raison de l’utilisation de médicaments ciblant le DDR pour le traitement du cancer. Ces cibles sont les poly(ADP-ribose) polymérases (PARP), qui initient diverses formes de réparation de l’ADN. L’inhibition de ces enzymes à l’aide d’inhibiteurs de PARP (PARPi) permet d’obtenir une létalité synthétique en conférant une vulnérabilité thérapeutique dans les cellules déficientes en recombinaison homologue (HR) en raison de mutations dans le cancer du sein de type 1 (BRCA1), BRCA2, ou partenaire et localisateur de BRCA2 (PALB2).
Les cellules traitées avec PARPi accumulent des cassures double brin d’ADN (DSB). Ces cassures sont traitées par la machinerie de résection de l’extrémité de l’ADN, ce qui conduit à la formation d’ADN simple brin (ss) et à la réparation ultérieure de l’ADN. Dans un contexte déficient en BRCA1, la revitalisation de la résection de l’ADN par des mutations dans les inhibiteurs de la résection de l’ADN, tels que 53BP1 et DYNLL1, provoque une résistance AU PARPi. Par conséquent, être capable de surveiller la résection de l’ADN dans le cellulo est essentiel pour une compréhension plus claire des voies de réparation de l’ADN et le développement de nouvelles stratégies pour surmonter la résistance PARPi. Les techniques basées sur l’immunofluorescence (FI) permettent de surveiller la résection globale de l’ADN après des dommages à l’ADN. Cette stratégie nécessite un marquage génomique de l’ADN à longue impulsion avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU). Après des dommages à l’ADN et une résection finale de l’ADN, l’ADN simple brin résultant est spécifiquement détecté par un anticorps anti-BrdU dans des conditions natives. De plus, la résection de l’ADN peut également être étudiée à l’aide de marqueurs du cycle cellulaire pour différencier les différentes phases du cycle cellulaire. Les cellules de la phase S/G2 permettent l’étude de la résection finale au sein de hr, tandis que les cellules G1 peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage final non homologue (NHEJ). Un protocole détaillé pour cette méthode IF couplée à la discrimination du cycle cellulaire est décrit dans ce document.
Introduction
La modulation des facteurs de réparation de l’ADN est une méthode en constante évolution pour le traitement du cancer, en particulier dans les environnements tumoraux déficients en réparation de l’ADN DSB. L’inhibition de facteurs de réparation spécifiques est l’une des stratégies ingénieuses utilisées pour sensibiliser les cellules cancéreuses aux agents endommageant l’ADN. Des décennies de recherche ont conduit à l’identification de diverses mutations de gènes de réparation de l’ADN en tant que biomarqueurs pour les choix de stratégie thérapeutique1. Par conséquent, le domaine de la réparation de l’ADN est devenu une plaque tournante pour le développement de médicaments afin d’assurer une large gamme de traitements, renforçant ainsi le concept de médecine personnalisée.
Les DSB sont réparés par deux voies principales : NHEJ et HR2. La voie NHEJ est sujette aux erreurs, ligaturant rapidement les deux extrémités de l’ADN avec peu ou pas de traitement final de l’ADN et impliquant la protéine kinase (DNA-PKcs), le complexe Ku70/80, 53BP1 et les protéines RIF13. En revanche, les RH sont un mécanisme fidèle initié par BRCA14. Une étape essentielle de la réparation HR est le processus de résection de l’extrémité de l’ADN, qui est la dégradation des extrémités cassées conduisant à l’ADN simple brin (ss) avec des extrémités 3′-OH. BRCA1 facilite le recrutement des protéines en aval qui forment le résectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, qui sont impliquées dans la résection de l’ADN 5′ à 3’5.
La résection finale initiale est réalisée grâce à l’activité endonucléase de MRE11, ce qui permet un traitement ultérieur par les nucléases DNA2 et EXO1. Les porte-à-faux d’ADNSS générés sont rapidement recouverts par la protéine de réplication A (RPA) pour les protéger d’un traitement ultérieur. Par la suite, BRCA2, PALB2 et BRCA1 s’engagent à arbitrer le déplacement de la RPA et l’assemblage du nucléofilament RAD51 requis pour le mécanisme de réparation dirigé par homologie. Un équilibre délicat entre l’utilisation de NHEJ et HR est nécessaire pour le maintien optimal de l’intégrité génomique. Le choix de la voie dépend de la phase du cycle cellulaire. HR est utilisé de préférence pendant les phases S à G2 où la résection de l’ADN est au plus haut niveau, et les chromatides sœurs sont disponibles pour assurer une réparation appropriée.
La poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1) est l’une des premières protéines recrutées dans le DSB. Il régule à la fois l’activité de résection et l’assemblage des effecteurs en aval impliqués dans le NHEJ5,6. PARP-1 est également nécessaire pour la réparation de la rupture simple brin de l’ADN pendant la réplication7,8. En raison de son rôle important dans la réparation de l’ADN, les inhibiteurs de PARP (PARPi) sont utilisés comme thérapies contre le cancer. Dans plusieurs cancers déficients en HR, le traitement par ParPi conduit à une réponse létale synthétique en raison de l’incapacité des cellules déficientes en HR à réparer les dommages accumulés par une voie alternative9,10. Il existe actuellement quatre PARPi approuvés par la FDA : Olaparib, Rucaparib, Niriparib et Talazoparib (également appelé BMN 673), qui sont utilisés pour divers traitements du cancer du sein et de l’ovaire11. Cependant, la résistance par parpi est courante, et une cause potentielle découle de la réacquisition de la compétence RH12. La perte ou l’inhibition de PARP-1 en présence d’irradiation dérégule la machinerie des résectosomes, conduisant à l’accumulation de tractus d’ADNSs plus longs13. Par conséquent, une étude approfondie de la résection de l’ADN in vivo est essentielle pour une meilleure compréhension des voies de réparation de l’ADN et le développement ultérieur de nouvelles stratégies pour traiter le cancer et surmonter la résistance parPi.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les événements de résection de l’ADN5. L’une de ces méthodes est la technique classique basée sur la FI permettant la coloration indirecte et la visualisation de l’ADN réséqué après DSB induit par le stress en utilisant un anticorps anti-RPA. Le marquage de l’ADN génomique avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) et la détection de l’ADNSS est une mesure directe des événements de résection de l’ADN. Il contourne la surveillance de la RPA, qui est impliquée dans de multiples processus cellulaires tels que la réplication de l’ADN. Dans la méthode décrite ici, les cellules incubées avec BrdU pour un seul cycle cellulaire permettent à BrdU d’être incorporé dans un brin de l’ADN cellulaire répliquant. Après résection, la coloration IF est réalisée dans des conditions permettant la détection de BrdU uniquement sous forme d’ADNSS, avec l’utilisation d’un anticorps anti-BrdU. Cet anticorps ne peut accéder qu’aux nucléotides BrdU exposés et ne détectera pas ceux intégrés dans l’ADN double brin. En utilisant la microscopie à fluorescence, l’ADN réséqué peut être visualisé sous la forme de foyers BrdU/ssDNA ponctués. L’intensité nucléaire de ces foyers peut être utilisée comme lecture pour quantifier la résection après des dommages à l’ADN. Cet article décrit étape par étape les processus de cette méthode, qui peut être appliquée à la plupart des lignées cellulaires de mammifères. Cette méthode devrait être d’une grande utilité en tant que moyen simple de surveiller la résection finale de l’ADN dans le cellulo, en tant que preuve de concept.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode qui utilise la coloration IF pour mesurer les variations de la résection de l’ADN dans le cellulo. La norme actuelle pour observer un effet sur la résection de l’ADN est la coloration RPA; cependant, il s’agit d’une méthode indirecte qui peut être influencée par la réplication de l’ADN. Auparavant, une autre technique DE RÉSECTION DE L’ADN basée sur l’incorporation de BrdU a été décrite pour classer les intensités résultantes dans les cellules BrdU posi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Marie-Christine Caron pour ses conseils techniques exceptionnels. Ce travail est soutenu par le financement des Instituts de recherche en santé du Canada J.Y.M (IRSC FDN-388879). J.-Y.M. est titulaire d’une chaire de recherche canadienne de niveau 1 en réparation de l’ADN et en thérapeutique du cancer. J.O’S est un boursier au doctorat frQS, et S.Y.M est un boursier postdoctoral FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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