Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла
Summary
В настоящем протоколе мы демонстрируем, как визуализировать двухцепочечную концевую резекцию ДНК во время фазы S/G2 клеточного цикла с использованием метода, основанного на иммунофлуоресценции.
Abstract
Изучение реакции на повреждение ДНК (DDR) является сложной и важной областью, которая стала только более важной из-за использования препаратов, нацеленных на DDR, для лечения рака. Этими мишенями являются поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARPs), которые инициируют различные формы репарации ДНК. Ингибирование этих ферментов с использованием ингибиторов PARP (PARPi) достигает синтетической летальности, придавая терапевтическую уязвимость гомологичным рекомбинационным (HR)-дефицитным клеткам из-за мутаций в раке молочной железы типа 1 (BRCA1), BRCA2 или партнере и локализаторе BRCA2 (PALB2).
Клетки, обработанные PARPi, накапливают двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Эти разрывы обрабатываются механизмом резекции конца ДНК, что приводит к образованию одноцепочечной (ss) ДНК и последующему восстановлению ДНК. В контексте дефицита BRCA1 оживление резекции ДНК посредством мутаций в ингибиторах резекции ДНК, таких как 53BP1 и DYNLL1, вызывает резистентность к PARPi. Поэтому возможность мониторинга резекции ДНК в целлюлозе имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и разработки новых стратегий преодоления резистентности к PARPi. Методы, основанные на иммунофлуоресценции (IF), позволяют контролировать глобальную резекцию ДНК после повреждения ДНК. Эта стратегия требует длинноимпульсной геномной маркировки ДНК 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU). После повреждения ДНК и резекции конца ДНК полученная одноцепочечная ДНК специфически обнаруживается анти-BrdU антителом в нативных условиях. Кроме того, резекция ДНК также может быть изучена с использованием маркеров клеточного цикла для дифференциации между различными фазами клеточного цикла. Клетки в фазе S/G2 позволяют изучать конечную резекцию в HR, тогда как клетки G1 могут быть использованы для изучения негомологичного конечного соединения (NHEJ). Подробный протокол для этого метода ПЧ в сочетании с дискриминацией клеточного цикла описан в этой статье.
Introduction
Модуляция факторов репарации ДНК является постоянно развивающимся методом терапии рака, особенно в опухолевых средах с дефицитом репарации ДНК DSB. Ингибирование специфических факторов репарации является одной из гениальных стратегий, используемых для сенсибилизации раковых клеток к агентам, повреждающим ДНК. Десятилетия исследований привели к выявлению различных мутаций генов репарации ДНК в качестве биомаркеров для выбора терапевтической стратегии1. Следовательно, область репарации ДНК стала центром разработки лекарств для обеспечения широкого спектра методов лечения, расширяя возможности концепции персонализированной медицины.
DSB ремонтируются двумя основными путями: NHEJ и HR2. Путь NHEJ подвержен ошибкам, быстро перевязывая два конца ДНК практически без конечной обработки ДНК и включая протеинкиназу (ДНК-PKcs), комплекс Ku70/80, белки 53BP1 и RIF13. Напротив, HR является верным механизмом, инициированным BRCA14. Важным шагом в восстановлении HR является процесс резекции конца ДНК, который представляет собой деградацию сломанных концов, приводящую к одноцепочечной (ss) ДНК с концами 3′-OH. BRCA1 облегчает набор нисходящих белков, которые образуют резектосому MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, которые участвуют в резекции ДНК от 5′ до 3’5.
Начальная конечная резекция осуществляется через эндонуклеазную активность MRE11, что позволяет проводить дальнейшую обработку нуклеазами DNA2 и EXO1. Генерируемые свесы ssDNA быстро покрываются репликационным белком A (RPA), чтобы защитить их от дальнейшей обработки. Впоследствии BRCA2, PALB2 и BRCA1 участвуют в опосредовании смещения RPA и сборки нуклеофиламента RAD51, необходимого для механизма репарации, направленного на гомологию. Тонкий баланс между использованием NHEJ и HR необходим для оптимального поддержания геномной целостности. Выбор пути зависит от фазы клеточного цикла. HR предпочтительно используется во время фаз от S до G2, где резекция ДНК находится на самом высоком уровне, а сестринские хроматиды доступны для обеспечения надлежащего восстановления.
Поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP-1) является одним из самых ранних белков, рекрутированных в DSB. Он регулирует как резекционную активность, так и сборку последующих эффекторов, участвующих в NHEJ5,6. PARP-1 также необходим для восстановления одноцепочечного разрыва ДНК во время репликации7,8. Благодаря своей важной роли в восстановлении ДНК, ингибиторы PARP (PARPi) используются в качестве терапии рака. При нескольких раковых заболеваниях с дефицитом HR лечение PARPi приводит к синтетическому летальному ответу из-за неспособности клеток с дефицитом HR восстанавливать накопленный ущерб с помощью альтернативного пути9,10. В настоящее время существует четыре одобренных FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib и Talazoparib (также называемый BMN 673), которые используются для различных методов лечения рака молочной железы и яичников11. Тем не менее, устойчивость к PARPi распространена, и одна потенциальная причина возникает в результате повторного приобретения навыков HR12. Потеря или ингибирование PARP-1 в присутствии облучения дисрегулирует механизм резектосомы, что приводит к накоплению более длинных трактов сдНК13. Поэтому углубленное изучение резекции ДНК in vivo имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и последующей разработки новых стратегий лечения рака и преодоления резистентности к PARPi.
Существует несколько методов, используемых для обнаружения событий резекции ДНК5. Одним из таких методов является классический метод на основе ПЧ, позволяющий косвенно окрашивать и визуализировать резецированную ДНК после вызванного стрессом DSB с использованием антитела против RPA. Маркировка геномной ДНК 5-бром-2′-дезоксиуридином (BrdU) и обнаружение только ssDNA является прямым измерением событий резекции ДНК. Он обходит мониторинг RPA, который участвует в нескольких клеточных процессах, таких как репликация ДНК. В способе, описанном здесь, клетки, инкубированные с BrdU в течение одного клеточного цикла, позволяют BrdU быть включенным в одну цепь реплицирующейся клеточной ДНК. После резекции окрашивание ПЧ проводят в условиях, допускающих обнаружение BrdU только в форме ssDNA, с использованием антитела против BrdU. Это антитело может получить доступ только к воздействию нуклеотидов BrdU и не будет обнаруживать те, которые интегрированы в двухцепочечную ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии резецированную ДНК можно визуализировать в виде пунктатных очагов BrdU/ssDNA. Ядерная интенсивность этих очагов может быть использована в качестве считывания для количественной оценки резекции после повреждения ДНК. В данной работе описаны пошаговые процессы данного метода, которые могут быть применены к большинству клеточных линий млекопитающих. Этот метод должен иметь широкую полезность как простой способ мониторинга резекции конца ДНК в целлюле, как доказательство концепции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается метод, который использует окрашивание ПЧ для измерения вариаций резекции ДНК в целлюлозе. В настоящее время стандартом для наблюдения за влиянием на резекцию ДНК является окрашивание RPA; однако это косвенный метод, на который может влиять репликация ДНК. ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мари-Кристин Карон за выдающиеся технические консультации. Эта работа поддерживается финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. занимает исследовательскую кафедру Tier 1 Canada в области репарации ДНК и терапии рака. J.O’S является аспирантом FRQS, а S.Y.M является постдокторантом FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
