Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular
Summary
No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.
Abstract
O estudo da resposta a danos no DNA (DDR) é um campo complexo e essencial, que só se tornou mais importante devido ao uso de medicamentos direcionados ao DDR para o tratamento do câncer. Estes alvos são poli (ADP-ribose) polimerases (PARPs), que iniciam várias formas de reparação de DNA. Inibir essas enzimas utilizando inibidores parp (PARPi) atinge a letalidade sintética conferindo uma vulnerabilidade terapêutica em células deficientes de recombinação homólogo (RH) devido a mutações no câncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2 ou parceiro e localizador do BRCA2 (PALB2).
As células tratadas com PARPi acumulam quebras de duplo fio de DNA (DSBs). Essas quebras são processadas pelo maquinário de ressecção final de DNA, levando à formação de DNA mono-encalhado (ss) e posterior reparação de DNA. Em um contexto deficiente brca1, revigorar a ressecção do DNA através de mutações em inibidores de ressecção de DNA, como 53BP1 e DYNLL1, causa resistência parpi. Portanto, ser capaz de monitorar a ressecção de DNA em celulose é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento de novas estratégias para superar a resistência do PARPi. As técnicas baseadas em imunofluorescência (IF) permitem o monitoramento da ressecção global de DNA após danos no DNA. Esta estratégia requer rotulagem de DNA genômico de pulso longo com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU). Após danos no DNA e ressecção da extremidade do DNA, o DNA de uma única cadeia resultante é especificamente detectado por um anticorpo anti-BrdU em condições nativas. Além disso, a ressecção de DNA também pode ser estudada usando marcadores de ciclo celular para diferenciar entre várias fases do ciclo celular. As células da fase S/G2 permitem o estudo da ressecção final dentro do RH, enquanto as células G1 podem ser usadas para estudar a junção final não homólogo (NHEJ). Um protocolo detalhado para este método IF acoplado à discriminação do ciclo celular é descrito neste artigo.
Introduction
Modulação de fatores de reparação de DNA é um método em constante evolução para a terapia do câncer, particularmente em ambientes tumorais deficientes de reparação de DNA DSB. A inibição de fatores de reparação específicos é uma das estratégias engenhosas usadas para sensibilizar as células cancerígenas para agentes prejudiciais ao DNA. Décadas de pesquisa levaram à identificação de várias mutações de genes de reparação de DNA como biomarcadores para escolhas de estratégia terapêutica1. Consequentemente, o campo de reparação de DNA tornou-se um centro de desenvolvimento de medicamentos para garantir uma ampla gama de tratamentos, capacitando o conceito de medicina personalizada.
Os DSBs são reparados por duas vias principais: NHEJ e HR2. A via NHEJ é propensa a erros, ligando rapidamente as duas extremidades de DNA com pouco ou nenhum processamento final de DNA e envolvendo a quinase proteica (DNA-PKcs), o complexo Ku70/80, 53BP1 e RIF1 proteins3. Em contrapartida, o RH é um mecanismo fiel iniciado pelo BRCA14. Um passo essencial na reparação do RH é o processo de ressecção do DNA-end, que é a degradação das extremidades quebradas levando ao DNA de um único fio (ss) com extremidades de 3′-OH. O BRCA1 facilita o recrutamento das proteínas a jusante que formam o resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que estão envolvidos na ressecção de DNA de 5′ a 3’5.
A ressecção final inicial é realizada através da atividade endonuclease do MRE11, permitindo um processamento adicional pelos núcleos DNA2 e EXO1. As ssDNA ssDNA geradas são rapidamente revestidas por Proteína de Replicação A (RPA) para protegê-los de mais processamento. Posteriormente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 se engajam para mediar o deslocamento do RPA e a montagem do nucleofilamento RAD51 necessário para o mecanismo de reparação direcionado à ímologia. Um bom equilíbrio entre o uso de NHEJ e RH é necessário para a manutenção ideal da integridade genômica. A escolha do caminho depende da fase do ciclo celular. O RH é usado preferencialmente durante as fases S e G2, onde a ressecção de DNA está no mais alto nível, e as cromátides irmãs estão disponíveis para garantir o reparo adequado.
Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1) é uma das primeiras proteínas recrutadas para o DSB. Regula tanto a atividade de ressecção quanto a montagem de efeitos a jusante envolvidos no NHEJ5,6. PARP-1 também é necessário para o reparo de quebra de um único fio de DNA durante a replicação7,8. Devido ao seu importante papel na reparação do DNA, os inibidores PARP (PARPi) são usados como terapias contra o câncer. Em vários cânceres deficientes de RH, o tratamento PARPi leva a uma resposta letal sintética devido à incapacidade das células deficientes de RH para reparar o dano acumulado através de uma via alternativa9,10. Atualmente existem quatro PARPi aprovados pela FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (também chamado de BMN 673), que são usados para vários tratamentos de câncer de mama e ovário11. No entanto, a resistência parpi é comum, e uma causa potencial surge através da reaquisição da proficiência em RH12. A perda ou inibição do PARP-1 na presença de irradiação desregula o maquinário resectoso, levando ao acúmulo de tratos SSDNA mais longos13. Portanto, um estudo aprofundado da ressecção de DNA in vivo é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento subsequente de novas estratégias para tratar o câncer e superar a resistência do PARPi.
Existem vários métodos empregados para detectar eventos de ressecção de DNA5. Um desses métodos é a técnica clássica baseada em IF que permite a coloração indireta e visualização do DNA ressecado após dSB induzido pelo estresse usando um anticorpo anti-RPA. Rotular DNA genômico com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) e detectar apenas ssDNA é uma medição direta de eventos de ressecção de DNA. Contorna o monitoramento do RPA, que está envolvido em múltiplos processos celulares, como a replicação de DNA. No método descrito aqui, as células incubadas com BrdU para um único ciclo celular permitem que BrdU seja incorporada em um fio do DNA celular replicante. Após a ressecção, a coloração if é realizada em condições que permitem a detecção de BrdU apenas na forma ssDNA, com o uso de um anticorpo anti-BrdU. Este anticorpo só pode acessar nucleotídeos brdu expostos e não detectará aqueles integrados em DNA de dupla cadeia. Utilizando microscopia de fluorescência, o DNA ressecado pode ser visualizado na forma de focos de BrdU/ssDNA pontuados. A intensidade nuclear desses focos pode ser usada como leitura para quantificar a ressecção após danos no DNA. Este artigo descreve passo a passo os processos deste método, que podem ser aplicados à maioria das linhas celulares de mamíferos. Este método deve ser de ampla utilidade como uma forma simples de monitorar a ressecção final do DNA no celulose, como prova de conceito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método que faz uso da coloração IF para medir variações na ressecção de DNA no celulose. O padrão atual para observar um efeito na ressecção do DNA é através da coloração de RPA; no entanto, este é um método indireto que pode ser influenciado pela replicação do DNA. Anteriormente, outra técnica de SEC baseada em incorporação de DNA baseada em BrdU foi descrita para classificar as intensidades resultantes em células brdU-positivas e brdU-negativos. Esse método permit…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marie-Christine Caron por um excelente conselho técnico. Este trabalho é apoiado por financiamento do Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. possui uma cadeira de pesquisa nível 1 no Canadá em reparação de DNA e terapêutica do câncer. J.O’S é um estudante de doutorado da FRQS, e S.Y.M é um pós-doutorando da FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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