הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא
Summary
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ”א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.
Abstract
המחקר של תגובת נזק ה- DNA (DDR) הוא תחום מורכב וחיוני, אשר רק הפך חשוב יותר בשל השימוש בתרופות ממוקדות DDR לטיפול בסרטן. מטרות אלה הן פולי (ADP-ריבוז) פולימראזים (PARPs), אשר יוזמים צורות שונות של תיקון DNA. עיכוב אנזימים אלה באמצעות מעכבי PARP (PARPi) משיג קטלניות סינתטית על ידי מתן פגיעות טיפולית בתאים רקומבינציה הומולוגית (HR) לקוי עקב מוטציות בסוג סרטן השד 1 (BRCA1), BRCA2, או שותף ולוקליזר של BRCA2 (PALB2).
תאים שטופלו ב- PARPi צוברים הפסקות דנ”א כפולות גדילים (DSB). הפסקות אלה מעובדות על ידי מכונות כריתת קצה ה- DNA, מה שמוביל להיווצרות DNA חד-גדילי (ss) ותיקון DNA לאחר מכן. בהקשר של מחסור ב-BRCA1, כריתת דנ”א מחודשת באמצעות מוטציות במעכבי כריתת דנ”א, כגון 53BP1 ו-DYNLL1, גורמת להתנגדות PARPi. לכן, היכולת לפקח על כריתת DNA בצלולו היא קריטית להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על התנגדות PARPi. טכניקות מבוססות אימונופלואורסצנטיות (IF) מאפשרות ניטור של כריתת דנ”א גלובלית לאחר נזק לדנ”א. אסטרטגיה זו דורשת תיוג דנ”א גנומי בעל דופק ארוך עם 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU). בעקבות נזק לדנ”א וחיתוך קצה דנ”א, הדנ”א החד-גדילי שנוצר מזוהה במיוחד על ידי נוגדן אנטי-BrdU בתנאים מקומיים. יתר על כן, כריתת DNA ניתן גם ללמוד באמצעות סמני מחזור התא כדי להבדיל בין שלבים שונים של מחזור התא. תאים בשלב S/G2 מאפשרים את חקר כריתת הקצה בתוך משאבי אנוש, בעוד שתאי G1 יכולים לשמש לחקר צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ). פרוטוקול מפורט עבור שיטת IF זו בשילוב עם אפליית מחזור תאים מתואר במאמר זה.
Introduction
אפנון של גורמי תיקון DNA היא שיטה המתפתחת ללא הרף לטיפול בסרטן, במיוחד בסביבות גידול לקוי תיקון DSB DNA. עיכוב גורמי תיקון ספציפיים הוא אחת האסטרטגיות הגאוניות המשמשות לרגישות תאים סרטניים לסוכנים מזיקים לדנ”א. עשרות שנים של מחקר הובילו לזיהוי מוטציות שונות של גנים לתיקון DNA כסמנים ביולוגיים לבחירות אסטרטגיה טיפולית1. כתוצאה מכך, תחום תיקון הדנ”א הפך למרכז לפיתוח תרופות כדי להבטיח מגוון רחב של טיפולים, להעצים את מושג הרפואה המותאמת אישית.
DSBs מתוקנים על ידי שני מסלולים עיקריים: NHEJ ו- HR2. מסלול ה- NHEJ נוטה לשגיאות, קושר במהירות את שני קצות הדנ”א עם עיבוד קצה של דנ”א מועט עד אפסי וכולל את קינאז החלבון (DNA-PKcs), קומפלקס Ku70/80, 53BP1 וחלבוני RIF13. לעומת זאת, משאבי אנוש הוא מנגנון נאמן ביוזמת BRCA14. צעד חיוני בתיקון משאבי אנוש הוא תהליך כריתת קצה ה- DNA, שהוא השפלה של הקצוות השבורים המובילים לדנ”א חד-גדילי (ss) עם קצות 3′-OH. BRCA1 מאפשר את גיוס החלבונים במורד הזרם היוצרים את ה- MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, המעורבים בכריתת ה- DNA 5 ‘ עד 3 ‘.
כריתת הקצה הראשונית מתבצעת באמצעות פעילות אנדונוקלאז של MRE11, המאפשר עיבוד נוסף על ידי נוקלאזים DNA2 ו- EXO1. ה- ssDNA overhangs שנוצר מצופים במהירות על ידי חלבון שכפול A (RPA) כדי להגן עליהם מפני עיבוד נוסף. לאחר מכן, BRCA2, PALB2 ו- BRCA1 עוסקים כדי לתווך את העקירה של RPA ואת ההרכבה של גרעין RAD51 הנדרש עבור מנגנון תיקון מונחה הומולוגיה. איזון עדין בין השימוש ב- NHEJ למשאבי אנוש נחוץ לשמירה מיטבית על שלמות גנומית. בחירת המסלול תלויה בשלב מחזור התא. משאבי אנוש משמשים באופן מועדף במהלך שלבי S עד G2 שבהם כריתת DNA היא ברמה הגבוהה ביותר, ואת הכרומטידים האחות זמינים כדי להבטיח תיקון נאות.
פולי (ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP-1) הוא אחד החלבונים המוקדמים ביותר שגויסו ל- DSB. זה מסדיר הן את פעילות הכריתה ואת ההרכבה של מפעילי במורד הזרם המעורבים NHEJ5,6. PARP-1 נדרש גם עבור DNA חד גדיל תיקון הפסקה תקוע במהלך שכפול7,8. בשל תפקידו החשוב בתיקון DNA, מעכבי PARP (PARPi) משמשים כטיפולים בסרטן. במספר סוגי סרטן לקויי משאבי אנוש, טיפול PARPi מוביל לתגובה קטלנית סינתטית בשל חוסר היכולת של תאים לקויי משאבי אנוש לתקן את הנזק המצטבר באמצעות מסלול חלופי9,10. ישנם כיום ארבעה PARPi שאושרו על ידי ה-FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, ו Talazoparib (המכונה גם BMN 673), אשר משמשים לטיפולים שונים בסרטן השד והשחלות11. עם זאת, התנגדות PARPi היא נפוצה, וסיבה פוטנציאלית אחת מתעוררת באמצעות השגת מיומנות משאבי אנוש12. אובדן או עיכוב של PARP-1 בנוכחות dysregulates הקרנה dysregulates המכונות resectosome, המוביל הצטברות של עלונים ssDNA ארוכים יותר13. לכן, מחקר מעמיק של כריתת DNA ב vivo הוא קריטי להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח לאחר מכן של אסטרטגיות חדשות לטיפול בסרטן ולהתגבר על התנגדות PARPi.
היו מספר שיטות שהופעלו כדי לזהות אירועי כריתת דנ”א5. שיטה אחת כזו היא הטכניקה הקלאסית המבוססת על IF המאפשרת כתמים עקיפים והדמיה של ה- DNA החתוך לאחר DSB המושרה בלחץ באמצעות נוגדן אנטי RPA. תיוג דנ”א גנומי עם 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) וגילוי רק ssDNA היא מדידה ישירה של אירועי כריתת DNA. זה עוקף את הניטור של RPA, אשר מעורב בתהליכים תאיים מרובים כגון שכפול DNA. בשיטה המתוארת כאן, תאים המדגרים עם BrdU למחזור תא יחיד מאפשרים ל- BrdU להיות משולב בגדיל אחד של ה- DNA התאי המשכפל. לאחר כריתה, אם כתמים מבוצעים בתנאים המאפשרים שבו גילוי BrdU רק בצורת ssDNA, עם שימוש בנוגדן נגד BrdU. נוגדן זה יכול לגשת רק לנוקלאוטידים חשופים של BrdU ולא יזהה את אלה המשולבים בדנ”א דו-גדילי. באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתן לדמיין את ה- DNA החתוך בצורה של מוקדי BrdU / ssDNA לנקב. העוצמה הגרעינית של מוקדים אלה יכולה לשמש כקריאה לכימות כריתה בעקבות נזק לדנ”א. מאמר זה מתאר צעד אחר צעד את התהליכים של שיטה זו, אשר ניתן להחיל על רוב קווי התאים של היונקים. שיטה זו צריכה להיות של תועלת רחבה כדרך פשוטה של ניטור כריתת קצה DNA בצלולו, כהוכחה של מושג.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה העושה שימוש בהכתמת IF כדי למדוד וריאציות בכריתת DNA בצלולו. התקן הנוכחי להתבוננות בהשפעה על כריתת DNA הוא באמצעות כתמי RPA; עם זאת, זוהי שיטה עקיפה שעשויה להיות מושפעת משכפול DNA. בעבר תוארה טכניקת IF נוספת המבוססת על התאגדות BrdU לסיווג העוצמות המתקבלות בתאי BrdU-positive ו- BrdU-negative. …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למארי-כריסטין קארון על העצה הטכנית יוצאת הדופן. עבודה זו נתמכת על ידי מימון של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. מחזיקה ב-Tier 1 Canada Research Chair בתיקון דנ”א וטיפול בסרטן. J.O’S הוא עמית דוקטורט FRQS, ו S.Y.M הוא עמית פוסט דוקטורט FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
