Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging
Summary
In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.
Abstract
De studie van de DNA-schaderespons (DDR) is een complex en essentieel veld, dat alleen maar belangrijker is geworden door het gebruik van DDR-gerichte geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Deze doelwitten zijn poly(ADP-ribose) polymerasen (PARP’s), die verschillende vormen van DNA-reparatie initiëren. Het remmen van deze enzymen met behulp van PARP-remmers (PARPi) bereikt synthetische letaliteit door een therapeutische kwetsbaarheid te verlenen in homologe recombinatie (HR) -deficiënte cellen als gevolg van mutaties in borstkanker type 1 (BRCA1), BRCA2 of partner en localizer van BRCA2 (PALB2).
Cellen behandeld met PARPi accumuleren DNA dubbelstrengs breuken (DSB’s). Deze breuken worden verwerkt door de DNA-eindresectiemachinerie, wat leidt tot de vorming van enkelstrengs (ss) DNA en daaropvolgende DNA-reparatie. In een BRCA1-deficiënte context veroorzaakt het nieuw leven inblazen van DNA-resectie door mutaties in DNA-resectieremmers, zoals 53BP1 en DYNLL1, PARPi-resistentie. Daarom is het kunnen monitoren van DNA-resectie in cellulo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om PARPi-resistentie te overwinnen. Immunofluorescentie (IF)-gebaseerde technieken maken het mogelijk om wereldwijde DNA-resectie na DNA-schade te monitoren. Deze strategie vereist lange-puls genomische DNA-etikettering met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU). Na DNA-schade en DNA-eindresectie wordt het resulterende enkelstrengs DNA specifiek gedetecteerd door een anti-BrdU-antilichaam onder inheemse omstandigheden. Bovendien kan DNA-resectie ook worden bestudeerd met behulp van celcyclusmarkers om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus. Cellen in de S/G2-fase maken de studie van eindresectie binnen HR mogelijk, terwijl G1-cellen kunnen worden gebruikt om niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) te bestuderen. Een gedetailleerd protocol voor deze IF-methode gekoppeld aan celcyclusdiscriminatie wordt in dit artikel beschreven.
Introduction
Modulatie van DNA-reparatiefactoren is een steeds evoluerende methode voor kankertherapie, met name in DNA DSB-reparatie-deficiënte tumoromgevingen. De remming van specifieke reparatiefactoren is een van de ingenieuze strategieën die worden gebruikt om kankercellen te sensibiliseren voor DNA-schadelijke stoffen. Tientallen jaren van onderzoek leidden tot de identificatie van verschillende mutaties van DNA-reparatiegenen als biomarkers voor therapeutische strategiekeuzes1. Bijgevolg is het DNA-reparatieveld een hub geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen om een breed scala aan behandelingen te garanderen, waardoor het concept van gepersonaliseerde geneeskunde wordt versterkt.
DSB’s worden gerepareerd door twee hoofdroutes: NHEJ en HR2. De NHEJ-route is foutgevoelig, waardoor de twee DNA-uiteinden snel worden geligeerd met weinig tot geen DNA-eindverwerking en waarbij het eiwitkinase (DNA-PKcs), het Ku70/80-complex, 53BP1 en RIF1-eiwitten3 betrokken zijn. HR daarentegen is een getrouw mechanisme geïnitieerd door BRCA14. Een essentiële stap in HR-reparatie is het DNA-end resectieproces, dat is de afbraak van de gebroken uiteinden die leidt tot enkelstrengs (ss) DNA met 3′-OH-uiteinden. BRCA1 vergemakkelijkt de rekrutering van de downstream eiwitten die het resectosoom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 vormen, die betrokken zijn bij de 5′ tot 3′ DNA-resectie5.
De initiële eindresectie wordt bereikt door de endonuclease-activiteit van MRE11, waardoor verdere verwerking door de DNA2- en EXO1-nucleasen mogelijk is. De gegenereerde ssDNA-overhangen worden snel gecoat met Replicatie-eiwit A (RPA) om ze te beschermen tegen verdere verwerking. Vervolgens nemen BRCA2, PALB2 en BRCA1 deel aan de bemiddeling van de verplaatsing van RPA en de assemblage van het RAD51-nucleofilament dat nodig is voor homologiegericht reparatiemechanisme. Een fijne balans tussen het gebruik van NHEJ en HR is noodzakelijk voor het optimale behoud van de genomische integriteit. De routekeuze hangt af van de celcyclusfase. HR wordt bij voorkeur gebruikt tijdens de S tot G2-fasen waarin DNA-resectie op het hoogste niveau is en de zusterchromatiden beschikbaar zijn om een goede reparatie te garanderen.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is een van de vroegste eiwitten die voor de DSB worden gerekruteerd. Het regelt zowel de resectieactiviteit als de assemblage van stroomafwaartse effectoren die betrokken zijn bij de NHEJ5,6. PARP-1 is ook vereist voor DNA enkelstrengs breukherstel tijdens replicatie7,8. Vanwege de belangrijke rol in DNA-reparatie worden PARP-remmers (PARPi) gebruikt als kankertherapieën. Bij verschillende HR-deficiënte kankers leidt parpi-behandeling tot een synthetische letale respons als gevolg van het onvermogen van HR-deficiënte cellen om de geaccumuleerde schade te herstellen via een alternatieve route9,10. Er zijn momenteel vier door de FDA goedgekeurde PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib en Talazoparib (ook wel BMN 673 genoemd), die worden gebruikt voor verschillende borst- en eierstokkankerbehandelingen11. PARPi-resistentie komt echter vaak voor en één mogelijke oorzaak ontstaat door de herovering van HR-vaardigheid12. Verlies of remming van PARP-1 in aanwezigheid van bestraling ontregelt de resectosoommachinerie, wat leidt tot de accumulatie van langere ssDNA-traktaten13. Daarom is een diepgaande studie van DNA-resectie in vivo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de daaropvolgende ontwikkeling van nieuwe strategieën om kanker te behandelen en PARPi-resistentie te overwinnen.
Er zijn verschillende methoden gebruikt om DNA-resectiegebeurtenissen te detecteren5. Een van die methoden is de klassieke IF-gebaseerde techniek die indirecte kleuring en visualisatie van het gereseceerde DNA na stress-geïnduceerde DSB mogelijk maakt met behulp van een anti-RPA-antilichaam. Het labelen van genomisch DNA met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) en het detecteren van alleen ssDNA is een directe meting van DNA-resectiegebeurtenissen. Het omzeilt de monitoring van RPA, die betrokken is bij meerdere cellulaire processen zoals DNA-replicatie. In de hier beschreven methode zorgen cellen geïncubeerd met BrdU voor een enkele celcyclus ervoor dat BrdU kan worden opgenomen in één streng van het replicerende cellulaire DNA. Na resectie wordt IF-kleuring uitgevoerd onder omstandigheden die BrdU-detectie alleen in de ssDNA-vorm mogelijk maken, met behulp van een anti-BrdU-antilichaam. Dit antilichaam heeft alleen toegang tot blootgestelde BrdU-nucleotiden en zal die niet detecteren die zijn geïntegreerd in dubbelstrengs DNA. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kan het gereseceerde DNA worden gevisualiseerd in de vorm van punctate BrdU/ ssDNA-foci. De nucleaire intensiteit van deze foci kan worden gebruikt als een uitlezing om resectie na DNA-schade te kwantificeren. Dit artikel beschrijft stap voor stap de processen van deze methode, die kunnen worden toegepast op de meeste cellijnen van zoogdieren. Deze methode zou van breed nut moeten zijn als een eenvoudige manier om DNA-eindresectie in cellulo te monitoren, als een proof of concept.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van IF-kleuring om variaties in DNA-resectie in cellulose te meten. De huidige standaard voor het observeren van een effect op DNA-resectie is door RPA-kleuring; dit is echter een indirecte methode die kan worden beïnvloed door DNA-replicatie. Eerder is een andere op BrdU-integratie gebaseerde DNA-resectie IF-techniek beschreven voor het classificeren van de resulterende intensiteiten in BrdU-positieve en BrdU-negatieve cellen. Met deze methode konden cellen …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Marie-Christine Caron voor haar uitstekende technische advies. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. bekleedt een Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O’S is een FRQS PhD student fellow, en S.Y.M is een FRQS postdoctoraal fellow.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D’Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
- Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
- Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
- Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
- Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
- Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
- Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
- Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
- Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).
