Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.
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Methodenartikel
Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird.
Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.
Einleitung
Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische Strategieentscheidungen1. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept d....
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Protokoll
1. Zellkultur, Behandlungen und Deckglasvorbereitung
HINWEIS: Alle Zellplattierungen, Transfektionen und Behandlungen, mit Ausnahme der Bestrahlung, sollten unter einer sterilen Zellkulturhaube stattfinden.
- Tag 1
- Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch.
HINWEIS: Bei der Transfektion wird empfohlen, zum Zeitpunkt der Beschichtung eine umgekehrte Transfektion durchzuführen, oder es ist möglich, einige Stunden nach der Beschichtung eine Vorwärtstransfektion du....
- Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch.
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Ergebnisse
In diesem Protokoll wurde der Bromodeoxyuridin (BrdU)-basierte Assay verwendet, um die Resektionsreaktion von HeLa-Zellen auf bestrahlungsinduzierte Schäden quantitativ zu messen. Die erzeugten ssDNA-Spuren werden nach der Immunfluoreszenzfärbung als unterschiedliche Herde visualisiert (Abbildung 1A). Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der BrdU-Färbung in den Kernen ausgedrückt (Abbildung 1B, Ergänzen.......
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Diskussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Methode .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Marie-Christine Caron für die hervorragende technische Beratung. Diese Arbeit wird durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879) unterstützt. J.-Y.M. hat einen Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics inne. J.O'S ist ein FRQS PhD Student Fellow und S.Y.M ist ein FRQS Postdoctoral Fellow.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 Anti-Kaninchen Anti-Kaninchen | Molekulare Sonden | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus | Molekulare Sonden | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Hausgemachte | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha Tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Tischgerät Röntgenstrahler | Zelle Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridin (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Zellprofiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM hoher Glukosegehalt | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Rinderserum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Deckgläser: Quadrate 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | DMI6000B | 63x Immersionsobjektiv |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INKUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Kanada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Kanada | SOD002.10 | |
| Nadel | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Eindeckmittel | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA Kontrolle | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Natriumdesoxycholcat | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Saccharose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher wissenschaftliche | Pinzette BP337500 | |
Referenzen
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
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Nachdrucke und Genehmigungen
