Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular
Summary
En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.
Abstract
El estudio de la respuesta al daño del ADN (DDR) es un campo complejo y esencial, que solo se ha vuelto más importante debido al uso de medicamentos dirigidos a DDR para el tratamiento del cáncer. Estos objetivos son las poli(ADP-ribosa) polimerasas (PARP), que inician diversas formas de reparación del ADN. La inhibición de estas enzimas utilizando inhibidores de PARP (PARPi) logra una letalidad sintética al conferir una vulnerabilidad terapéutica en células deficientes en recombinación homóloga (HR) debido a mutaciones en cáncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2, o pareja y localizador de BRCA2 (PALB2).
Las células tratadas con PARPi acumulan roturas de doble cadena de ADN (DSB). Estas roturas son procesadas por la maquinaria de resección final del ADN, lo que lleva a la formación de ADN monocatenario (ss) y la posterior reparación del ADN. En un contexto deficiente en BRCA1, la revitalización de la resección del ADN a través de mutaciones en los inhibidores de la resección del ADN, como 53BP1 y DYNLL1, causa resistencia a PARPi. Por lo tanto, ser capaz de monitorear la resección del ADN en el celulo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el desarrollo de nuevas estrategias para superar la resistencia a PARPi. Las técnicas basadas en la inmunofluorescencia (IF) permiten monitorear la resección global del ADN después del daño del ADN. Esta estrategia requiere el etiquetado de ADN genómico de pulso largo con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU). Después del daño del ADN y la resección final del ADN, el ADN monocatenario resultante es detectado específicamente por un anticuerpo anti-BrdU en condiciones nativas. Además, la resección del ADN también se puede estudiar utilizando marcadores del ciclo celular para diferenciar entre varias fases del ciclo celular. Las células en la fase S/G2 permiten el estudio de la resección final dentro de HR, mientras que las células G1 se pueden utilizar para estudiar la unión final no homóloga (NHEJ). En este documento se describe un protocolo detallado para este método IF acoplado a la discriminación del ciclo celular.
Introduction
La modulación de los factores de reparación del ADN es un método en constante evolución para la terapia del cáncer, particularmente en entornos tumorales deficientes en la reparación del DSB de ADN. La inhibición de factores de reparación específicos es una de las ingeniosas estrategias utilizadas para sensibilizar a las células cancerosas a agentes dañinos para el ADN. Décadas de investigación condujeron a la identificación de varias mutaciones de genes de reparación del ADN como biomarcadores para las opciones de estrategia terapéutica1. En consecuencia, el campo de la reparación del ADN se ha convertido en un centro para el desarrollo de fármacos para garantizar una amplia gama de tratamientos, potenciando el concepto de medicina personalizada.
Los DSB son reparados por dos vías principales: NHEJ y HR2. La vía NHEJ es propensa a errores, ligando rápidamente los dos extremos de ADN con poco o ningún procesamiento final de ADN e involucrando la proteína quinasa (DNA-PKCs), el complejo Ku70/80, 53BP1 y las proteínas RIF13. En contraste, la RRHH es un mecanismo fiel iniciado por BRCA14. Un paso esencial en la reparación de HR es el proceso de resección del extremo del ADN, que es la degradación de los extremos rotos que conduce a ADN monocatenario (ss) con extremos 3′-OH. BRCA1 facilita el reclutamiento de las proteínas aguas abajo que forman el resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que intervienen en la resección del ADN de 5′ a 3’5.
La resección final inicial se logra a través de la actividad de endonucleasa de MRE11, lo que permite un procesamiento posterior por parte de las nucleasas DNA2 y EXO1. Los voladizos de ssDNA generados son rápidamente recubiertos por la proteína de replicación A (RPA) para protegerlos de un procesamiento posterior. Posteriormente, BRCA2, PALB2 y BRCA1 se comprometen a mediar en el desplazamiento de RPA y el ensamblaje del nucleofilamento RAD51 requerido para el mecanismo de reparación dirigido por homología. Un equilibrio fino entre el uso de NHEJ y HR es necesario para el mantenimiento óptimo de la integridad genómica. La elección de la vía depende de la fase del ciclo celular. HR se utiliza preferentemente durante las fases S a G2 en las que la resección de ADN está en el nivel más alto, y las cromátidas hermanas están disponibles para garantizar una reparación adecuada.
La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) es una de las primeras proteínas reclutadas para el DSB. Regula tanto la actividad de resección como el ensamblaje de los efectores aguas abajo implicados en el NHEJ5,6. PARP-1 también es necesario para la reparación de roturas monocatenarias de ADN durante la replicación7,8. Debido a su importante papel en la reparación del ADN, los inhibidores de PARP (PARPi) se utilizan como terapias contra el cáncer. En varios cánceres con deficiencia de FC, el tratamiento con PARPi conduce a una respuesta letal sintética debido a la incapacidad de las células deficientes en HR para reparar el daño acumulado a través de una vía alternativa9,10. Actualmente hay cuatro PARPi aprobados por la FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib y Talazoparib (también llamado BMN 673), que se utilizan para diversos tratamientos contra el cáncer de mama y ovario11. Sin embargo, la resistencia a PARPi es común, y una causa potencial surge a través de la readquisición de la competencia en RRHH12. La pérdida o inhibición de PARP-1 en presencia de irradiación desregula la maquinaria del resectosoma, lo que lleva a la acumulación de tractos ssDNA más largos13. Por lo tanto, un estudio en profundidad de la resección del ADN in vivo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el posterior desarrollo de nuevas estrategias para tratar el cáncer y superar la resistencia a PARPi.
Se han empleado varios métodos para detectar eventos de resección de ADN5. Uno de estos métodos es la técnica clásica basada en IF que permite la tinción indirecta y la visualización del ADN resecado después de un DSB inducido por estrés mediante el uso de un anticuerpo anti-RPA. Etiquetar el ADN genómico con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) y detectar solo ssDNA es una medida directa de los eventos de resección del ADN. Elude el monitoreo de RPA, que está involucrado en múltiples procesos celulares como la replicación del ADN. En el método descrito aquí, las células incubadas con BrdU para un solo ciclo celular permiten que BrdU se incorpore a una hebra del ADN celular replicante. Después de la resección, la tinción de IF se realiza en condiciones que permiten la detección de BrdU solo en forma de ssDNA, con el uso de un anticuerpo anti-BrdU. Este anticuerpo solo puede acceder a los nucleótidos brdU expuestos y no detectará los integrados en el ADN de doble cadena. Utilizando microscopía de fluorescencia, el ADN resecado se puede visualizar en forma de focos de BrdU/ssDNA punteados. La intensidad nuclear de estos focos se puede utilizar como una lectura para cuantificar la resección después del daño en el ADN. Este artículo describe paso a paso los procesos de este método, que se puede aplicar a la mayoría de las líneas celulares de mamíferos. Este método debe ser de amplia utilidad como una forma simple de monitorear la resección final del ADN en el celulo, como prueba de concepto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método que hace uso de la tinción IF para medir las variaciones en la resección del ADN en el celulo. El estándar actual para observar un efecto sobre la resección del ADN es a través de la tinción RPA; sin embargo, este es un método indirecto que puede estar influenciado por la replicación del ADN. Anteriormente, se ha descrito otra técnica de RESECCIÓN DE ADN basada en la incorporación de BrdU para clasificar las intensidades resultantes en células BrdU positivas y BrdU …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marie-Christine Caron por su excelente asesoramiento técnico. Este trabajo está respaldado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. tiene una Cátedra de Investigación de Nivel 1 de Canadá en Reparación del ADN y Terapéutica del Cáncer. J.O’S es un becario de doctorado de FRQS, y S.Y.M es un becario postdoctoral de FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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