BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価
Summary
本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。
Abstract
DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。
PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。
Introduction
DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。
DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3′-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5’~3’DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルートを促進します5。
初期末端切除は、MRE11のエンドヌクレアーゼ活性を介して達成され、DNA2およびEXO1ヌクレアーゼによるさらなる処理を可能にする。生成されたssDNAオーバーハングは、レプリケーションプロテインA(RPA)によって迅速にコーティングされ、さらなる処理から保護されます。続いて、BRCA2、PALB2、およびBRCA1は、RPAの変位および相同性指向性修復機構に必要なRAD51ヌクレオフィラメントの組み立てを媒介するために関与する。NHEJとHRの使用の微妙なバランスは、ゲノム完全性の最適な維持のために必要である。経路の選択は、細胞周期の段階に依存する。HRは、DNA切除が最高レベルにあるS期からG2期にかけて優先的に使用され、姉妹染色分体が適切な修復を確実にするために利用可能である。
ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DSBにリクルートされた最も初期のタンパク質の1つである。これは、切除活性とNHEJ5,6に関与する下流エフェクターの組み立ての両方を調節する。PARP-1は、複製中のDNA一本鎖切断修復にも必要です7,8。DNA修復におけるその重要な役割のために、PARP阻害剤(PARPi)は癌治療として使用されている。いくつかのHR欠損がんにおいて、PARPi治療は、代替経路を介して蓄積された損傷を修復するHR欠損細胞の能力がないため、合成致死的応答をもたらす9,10。現在、FDAが承認したPARPiは、オラパリブ、ルカパリブ、ニリパリブ、タラゾパリブ(BMN 673とも呼ばれる)の4種類で、乳がんや卵巣がんのさまざまな治療に使用されています11。しかし、PARPi耐性は一般的であり、1つの潜在的な原因は、HR能力の再獲得によって生じる12。照射の存在下でのPARP−1の喪失または阻害は、切除体機構を調節不全にし、より長いssDNA経路の蓄積をもたらす13。したがって、インビボでのDNA切除の詳細な研究は、DNA修復経路のより明確な理解と、その後のがん治療およびPARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要である。
DNA切除イベントを検出するためにいくつかの方法が採用されています5。そのような方法の1つは、抗RPA抗体を使用してストレス誘発DSB後に切除されたDNAの間接染色および可視化を可能にする古典的なIFベースの技術である。ゲノムDNAを5-ブロモ-2′-デオキシウリジン(BrdU)で標識し、ssDNAのみを検出することは、DNA切除事象の直接測定です。これは、DNA複製などの複数の細胞プロセスに関与するRPAのモニタリングを回避します。本明細書に記載の方法では、単一細胞周期の間BrdUと共にインキュベートされた細胞は、BrdUが複製細胞DNAの1本の鎖に組み込まれることを可能にする。切除に続いて、IF染色は、抗BrdU抗体の使用により、ssDNA形態においてのみBrdU検出を可能にする条件下で行われる。この抗体は、露出したBrdUヌクレオチドにのみアクセスでき、二本鎖DNAに組み込まれたものは検出しません。蛍光顕微鏡を用いて、切除されたDNAを点状BrdU/ssDNA病巣の形で可視化することができる。これらの病巣の核強度は、DNA損傷後の切除を定量化するための読み出しとして使用することができる。この論文では、ほとんどの哺乳動物細胞株に適用できるこの方法のプロセスを段階的に説明します。この方法は、セル ロのDNA末端切除をモニタリングする簡単な方法として、概念実証として幅広い有用性を持つべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O’SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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