세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가
Summary
본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
DNA 손상 반응(DDR)의 연구는 복잡하고 필수적인 분야이며, 이는 암 치료를 위한 DDR 표적 약물의 사용으로 인해 더욱 중요해졌습니다. 이러한 표적은 다양한 형태의 DNA 수리를 시작하는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP)입니다. PARP 억제제(PARPi)를 사용하여 이러한 효소를 억제하는 것은 유방암 유형 1(BRCA1), BRCA2 또는 BRCA2(PALB2)의 파트너 및 국소화로 인한 동종 재조합(HR)-결핍세포에 대한 치료적 취약성을 부여하여 합성 치사를 달성한다.
PARPi로 처리된 세포는 DNA 이중 가닥 휴식(DSBs)을 축적한다. 이러한 휴식은 DNA 끝 절제 기계에 의해 처리되며, 단일 좌초 (ss) DNA 및 후속 DNA 수리의 형성으로 이어진다. BRCA1 결핍 맥락에서, DNA 절제술 억제제의 돌연변이를 통해 DNA 절제술을 통해 DNA 절제술을 재활성화, 와 같은 53BP1 및 DYNLL1, PARPi 저항을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 셀룰로에서 DNA 절제술을 모니터링할 수 있는 것은 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 개발에 매우 중요합니다. 면역 형광 (IF) 기반 기술은 DNA 손상 후 글로벌 DNA 절제술의 모니터링을 허용합니다. 이 전략은 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)와 긴 펄스 게놈 DNA 라벨을 필요로합니다. DNA 손상 및 DNA 끝 절제술에 이어, 생성된 단일 좌초 DNA는 네이티브 조건하에서 항 BrdU 항체에 의해 구체적으로 검출된다. 더욱이, DNA 절제술은 세포 주기 마커를 사용하여 세포 주기의 다양한 단계를 구별하는 연구될 수 있다. S/G2 상에 있는 세포는 G1 세포가 비 동형 종결합 (NHEJ)를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 반면, HR 내의 끝 절제술의 연구를 허용합니다. 세포 주기 차별과 결합된 이 IF 방법에 대한 자세한 프로토콜은 이 논문에 설명되어 있습니다.
Introduction
DNA 수리 인자의 변조는 암 치료를 위한 끊임없이 진화하는 방법, 특히 DNA DSB 복구 결핍 종양 환경에서. 특정 수리 요인의 억제는 DNA 손상 에이전트에 암세포를 민감하게 하는 데 사용 되는 독창적인 전략 중 하나입니다. 연구의 수십 년 치료 전략 선택에 대 한 바이오 마커로 DNA 복구 유전자의 다양 한 돌연변이의 식별으로 주도 1. 결과적으로 DNA 수리 분야는 다양한 치료법을 보장하기 위한 약물 개발의 허브가 되어 개인화된 의학 개념을 강화합니다.
DSB는 NHEJ와 HR2의 두 가지 주요 경로에 의해 수리됩니다. NHEJ 통로는 오류가 발생하기 쉽고, 두 DNA 끝을 DNA 최종 처리가 거의 또는 전혀 없이 빠르게 결합하고 단백질 키나아제(DNA-PKcs), Ku70/80 복합체, 53BP1 및 RIF1 단백질3와 관련이 있습니다. 대조적으로, HR은 BRCA14에 의해 시작된 충실한 기계장치입니다. HR 수리의 필수적인 단계는 DNA-말 절제 과정으로, 이는 3′-OH 끝이 있는 단면(ss) DNA로 이어지는 깨진 끝의 저하입니다. BRCA1은 5’에서 3’DNA 절제술5에 관여하는 절제된 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1을 형성하는 다운스트림 단백질의 모집을 용이하게 합니다.
초기 말절제는 MRE11의 엔도나클레스 활성을 통해 달성되어 DNA2 및 EXO1 뉴클레아제에 의한 추가 처리를 가능하게 한다. 생성된 ssDNA 오버행은 복제 단백질 A(RPA)에 의해 신속하게 코팅되어 추가 처리로부터 보호합니다. 그 후, BRCA2, PALB2 및 BRCA1은 상동성 지향 수리 메커니즘에 필요한 RPA의 변위와 RAD51 핵필라멘트의 조립을 중재하기 위해 관여한다. 유전체 무결성의 최적 유지 보수를 위해서는 NHEJ와 HR의 사용 사이의 미세한 균형이 필요합니다. 통로 선택은 세포 주기 단계에 달려 있습니다. HR은 DNA 절제술이 최고 수준에 있는 것을 내다의 S에서 G2 단계 도중 우대적으로 이용되고, 자매 크로마티드는 적당한 수리를 지키기 위하여 유효합니다.
폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1(PARP-1)은 DSB에 채용된 초기 단백질 중 하나입니다. 그것은 NHEJ5,6에 관련 된 하류 효과의 절제술 활동 및 조립을 모두 조절. PARP-1은 복제 7,8 동안 DNA 단일 좌초 휴식 수리에도 필요합니다. DNA 수리에 있는 그것의 중요한 역할 때문에, PARP 억제제 (PARPi)는 암 치료로 이용됩니다. 몇몇 HR 결핍암에서, PARPi 처리는 대체 통로를 통해 축적된 손상을 복구하기 위하여 HR 결핍세포의 무능력 때문에 합성 치명적인 반응으로 이끌어 냅니다9,10. 현재 4개의 FDA 승인 PARPi가 있습니다: 올라파리브, 루카파립, 니리파립, 탈라조파립(BMN 673이라고도 함) 등 다양한 유방암 및 난소암 치료에 사용됩니다11. 그러나 PARPi 저항은 일반적이며, HR 능력의 재수집을 통해 하나의 잠재적 인 원인이 발생12. 조사 의 존재에 PARP-1의 손실 또는 억제는 방부성 기계를 조절, 더 긴 ssDNA 기관13의 축적으로 이어지는. 따라서 생체 내 DNA 절제술에 대한 심층 연구는 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 암을 치료하고 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 후속 개발에 매우 중요합니다.
DNA 절제술 이벤트를 검출하기 위하여 채택된 몇몇 방법이 있었습니다5. 이러한 방법 중 하나는 반대로 RPA 항체를 이용하여 스트레스 유도 DSB 후 절제된 DNA의 간접 염색 및 시각화를 허용하는 고전적인 IF 기반 기술이다. 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)로 게놈 DNA를 표시하고 ssDNA만 검출하는 것은 DNA 절제술 이벤트의 직접적인 측정입니다. 그것은 DNA 복제와 같은 다중 세포 프로세스에 관여하는 RPA의 감시를 우회합니다. 여기서 설명된 방법에서, 단일 세포 주기를 위해 BrdU와 함께 배양된 세포는 BrdU가 복제 세포 DNA의 한 가닥으로 통합될 수 있게 한다. 다음 절제술, IF 염색은 BrdU가 ssDNA 형태로만 검출할 수 있도록 하는 조건하에서 수행되며, 반대로 BrdU 항체를 사용한다. 이 항체는 노출된 BrdU 뉴클레오티드에만 접근할 수 있으며 이중 좌초 된 DNA에 통합 된 것을 감지하지 않습니다. 형광 현미경 검사를 사용하여, 절제된 DNA는 BrdU/ssDNA foci를 천시테이트의 형태로 시각화할 수 있습니다. 이러한 포시의 핵 강도는 DNA 손상 에 따라 절제술을 정량화하기 위한 판독선으로 사용될 수 있다. 이 논문은 대부분의 포유류 세포주에 적용될 수 있는 이 방법의 과정을 단계별로 설명합니다. 이 방법은 개념의 증거로 셀룰로에서 DNA 끝 절제술을 모니터링하는 간단한 방법으로 광범위한 유틸리티가어야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 셀룰로의 DNA 절제술의 변이를 측정하기 위해 IF 염색을 사용하는 방법을 설명합니다. DNA 절제술에 대한 효과를 관찰하기위한 현재 표준은 RPA 염색을 통해; 그러나, 이것은 DNA 복제에 의해 영향을 받을 수 있는 간접적인 방법입니다. 이전에는 BrdU-정산 DNA 절제술 IF 기술이 BrdU 양성 및 BrdU-음성 세포의 결과로 발생하는 강도를 분류하기 위해 설명되었습니다. 이 방법은 HR을 거치지 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 뛰어난 기술 적 조언에 대한 마리 크리스틴 카론 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 J.Y.M (CIHR FDN-388879)의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 받고 있습니다. J.-Y.M. DNA 수리 및 암 치료제에서 1단계 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다. J.O’S는 FRQS 박사 과정 학생 펠로우이며, S.Y.M박사 후 펠로우입니다.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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