Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare
Summary
Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull’immunofluorescenza.
Abstract
Lo studio della risposta al danno al DNA (DDR) è un campo complesso ed essenziale, che è diventato più importante solo a causa dell’uso di farmaci mirati alla DDR per il trattamento del cancro. Questi bersagli sono poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che avviano varie forme di riparazione del DNA. L’inibizione di questi enzimi utilizzando inibitori PARP (PARPi) raggiunge una letalità sintetica conferendo una vulnerabilità terapeutica nelle cellule carenti di ricombinazione omologa (HR) a causa di mutazioni nel cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), BRCA2 o partner e localizzatore di BRCA2 (PALB2).
Le cellule trattate con PARPi accumulano rotture a doppio filamento di DNA (DSB). Queste rotture vengono elaborate dal meccanismo di resezione finale del DNA, portando alla formazione di DNA a singolo filamento (ss) e alla successiva riparazione del DNA. In un contesto carente di BRCA1, la resezione rinvigorente del DNA attraverso mutazioni in inibitori della resezione del DNA, come 53BP1 e DYNLL1, causa resistenza al PARPi. Pertanto, essere in grado di monitorare la resezione del DNA nel cellulo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e lo sviluppo di nuove strategie per superare la resistenza al PARPi. Le tecniche basate sull’immunofluorescenza (IF) consentono il monitoraggio della resezione globale del DNA dopo il danno al DNA. Questa strategia richiede l’etichettatura del DNA genomico a impulsi lunghi con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU). Dopo il danno al DNA e la resezione finale del DNA, il DNA a singolo filamento risultante viene specificamente rilevato da un anticorpo anti-BrdU in condizioni native. Inoltre, la resezione del DNA può anche essere studiata utilizzando marcatori del ciclo cellulare per differenziare tra le varie fasi del ciclo cellulare. Le cellule nella fase S/G2 consentono lo studio della resezione finale all’interno di HR, mentre le cellule G1 possono essere utilizzate per studiare l’unione finale non omologa (NHEJ). Un protocollo dettagliato per questo metodo IF accoppiato alla discriminazione del ciclo cellulare è descritto in questo documento.
Introduction
La modulazione dei fattori di riparazione del DNA è un metodo in continua evoluzione per la terapia del cancro, in particolare negli ambienti tumorali carenti di riparazione del DNA DSB. L’inibizione di specifici fattori di riparazione è una delle strategie ingegnose utilizzate per sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti dannosi per il DNA. Decenni di ricerca hanno portato all’identificazione di varie mutazioni dei geni di riparazione del DNA come biomarcatori per le scelte di strategia terapeutica1. Di conseguenza, il campo della riparazione del DNA è diventato un hub per lo sviluppo di farmaci per garantire una vasta gamma di trattamenti, potenziando il concetto di medicina personalizzata.
I DSB vengono riparati da due percorsi principali: NHEJ e HR2. La via NHEJ è soggetta a errori, legando rapidamente le due estremità del DNA con poca o nessuna elaborazione finale del DNA e coinvolgendo la proteina chinasi (DNA-PKcs), il complesso Ku70/80, le proteine 53BP1 e RIF13. Al contrario, HR è un meccanismo fedele avviato da BRCA14. Un passo essenziale nella riparazione delle risorse umane è il processo di resezione dell’estremità del DNA, che è la degradazione delle estremità rotte che porta al DNA a singolo filamento (ss) con estremità 3′-OH. BRCA1 facilita il reclutamento delle proteine a valle che formano il resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, che sono coinvolte nella resezione del DNA da 5′ a 3’5.
La resezione finale iniziale viene effettuata attraverso l’attività endonucleasi di MRE11, consentendo un’ulteriore elaborazione da parte delle nucleasi DNA2 ed EXO1. Gli sbalzi di ssDNA generati vengono rapidamente rivestiti dalla proteina di replicazione A (RPA) per proteggerli da ulteriori elaborazioni. Successivamente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 si impegnano a mediare lo spostamento di RPA e l’assemblaggio del nucleofilamento RAD51 necessario per il meccanismo di riparazione diretto all’omologia. Un buon equilibrio tra l’uso di NHEJ e HR è necessario per il mantenimento ottimale dell’integrità genomica. La scelta del percorso dipende dalla fase del ciclo cellulare. L’HR viene utilizzato preferenzialmente durante le fasi da S a G2 in cui la resezione del DNA è al più alto livello e i cromatidi fratelli sono disponibili per garantire una corretta riparazione.
La poli (ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP-1) è una delle prime proteine reclutate nel DSB. Regola sia l’attività di resezione che l’assemblaggio di effettori a valle coinvolti nel NHEJ5,6. PARP-1 è anche necessario per la riparazione della rottura a singolo filamento del DNA durante la replicazione7,8. A causa del suo importante ruolo nella riparazione del DNA, gli inibitori PARP (PARPi) sono usati come terapie contro il cancro. In diversi tumori con deficit di HR, il trattamento con PARPi porta a una risposta letale sintetica a causa dell’incapacità delle cellule carenti di HR di riparare il danno accumulato attraverso un percorso alternativo9,10. Attualmente ci sono quattro PARPi approvati dalla FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (chiamato anche BMN 673), che vengono utilizzati per vari trattamenti per il cancro al seno e alle ovaie11. Tuttavia, la resistenza PARPi è comune e una potenziale causa sorge attraverso la riacquisizione della competenza HR12. La perdita o l’inibizione di PARP-1 in presenza di irradiazione disregola il meccanismo del resettosoma, portando all’accumulo di tratti ssDNA più lunghi13. Pertanto, uno studio approfondito della resezione del DNA in vivo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e il successivo sviluppo di nuove strategie per trattare il cancro e superare la resistenza al PARPi.
Ci sono stati diversi metodi impiegati per rilevare gli eventi di resezione del DNA5. Uno di questi metodi è la classica tecnica basata su IF che consente la colorazione indiretta e la visualizzazione del DNA resecato dopo DSB indotto da stress utilizzando un anticorpo anti-RPA. Etichettare il DNA genomico con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) e rilevare solo ssDNA è una misura diretta degli eventi di resezione del DNA. Aggira il monitoraggio dell’RPA, che è coinvolto in più processi cellulari come la replicazione del DNA. Nel metodo qui descritto, le cellule incubate con BrdU per un singolo ciclo cellulare consentono a BrdU di essere incorporato in un filamento del DNA cellulare replicante. Dopo la resezione, la colorazione IF viene eseguita in condizioni che consentono il rilevamento di BrdU solo nella forma ssDNA, con l’uso di un anticorpo anti-BrdU. Questo anticorpo può accedere solo ai nucleotidi BrdU esposti e non rileverà quelli integrati nel DNA a doppio filamento. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, il DNA resecato può essere visualizzato sotto forma di focolai puntati brdU / ssDNA. L’intensità nucleare di questi fuochi può essere utilizzata come lettura per quantificare la resezione a seguito di danno al DNA. Questo documento descrive passo dopo passo i processi di questo metodo, che può essere applicato alla maggior parte delle linee cellulari di mammiferi. Questo metodo dovrebbe essere di ampia utilità come un modo semplice per monitorare la resezione finale del DNA nel cellulo, come prova di concetto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento descrive un metodo che utilizza la colorazione IF per misurare le variazioni nella resezione del DNA nel cellulo. Lo standard attuale per osservare un effetto sulla resezione del DNA è attraverso la colorazione RPA; tuttavia, questo è un metodo indiretto che può essere influenzato dalla replicazione del DNA. In precedenza, è stata descritta un’altra tecnica IF di resezione del DNA basata sull’incorporazione di BrdU per classificare le intensità risultanti nelle cellule BrdU-positive e BrdU-…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Marie-Christine Caron per l’eccellente consulenza tecnica. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. detiene una cattedra di ricerca canadese di livello 1 in riparazione del DNA e terapie del cancro. J.O’S è uno studente di dottorato FRQS e S.Y.M è un borsista post-dottorato FRQS.
Materials
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Molecular probes | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Molecular probes | A11001 | 1:800 |
| Anti PARP1 (F1-23) | Homemade | 1:2500 | |
| Anti PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| Anti-Alpha tubulin (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| Benchtop X-ray Irradiator | Cell Rad | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Cell profiler | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM high glucose | Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| Fluorescent microscope | Leica | DMI6000B | 63x immersion objective |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| Needle | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| Sodium Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sucrose | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| Tweezers |
Referenzen
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