متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
توفر على microfluidics الحبرية منبرا للعلم الأحياء إنتاجية عالية من compartmentalizing التجارب في عدد كبير من قطرات مائية معلقة في الناقل للنفط 1. وقد استخدمت قطرات لتطبيقات متنوعة مثل تحليل خلية واحدة 2، البلمرة الرقمي سلسلة من ردود الفعل (PCR) 3، وانزيم تطور 4. المقايسات الفلورسنت هي الوضع العادي من الكشف عن على microfluidics الحبرية، وإشاراتها مشرقة وزمن الاستجابة سريعة متوافقة مع اكتشاف كميات قطرات نانولتر الفرعي في معدلات كيلوهيرتز. تتطلب العديد من التطبيقات الكشف عن مضان لمدة سنتين على الأقل الألوان في وقت واحد. على سبيل المثال، لدينا مختبر يؤدي عادة PCR تنشيط قطرة فرز التجارب التي تستخدم القناة كشف واحد لنتيجة لفحص، ويستخدم صبغة خلفية الثانوي لجعل-فحص سلبي قطرة قابل للعد 5.
محطات الكشف نموذجية لعلى microfluidics الحبرية هي باالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على المجاهر epifluorescence، وتتطلب معقدة مخططات التلاعب الخفيفة لإدخال ضوء الإثارة من الليزر مساحة حرة داخل المجهر لأن تركز على العينة. بعد خروجه مضان من قطرات، يتم تصفية ضوء fluoresced المنبعثة بحيث تستخدم كل قناة الكشف عن أنبوب مضخم واحد (PMT) تركزت على نطاق الطول الموجي. توفر أنظمة الكشف البصري Epifluorescence أساس المجهر عائقا أمام دخول السوق بسبب نفقتهم والتعقيد، وتتطلب صيانة. توفر الألياف البصرية وسيلة لبناء نظام كشف مبسط وقوية، منذ الألياف يمكن إدراجها يدويا في أجهزة ميكروفلويديك، وإزالة الحاجة لالقائم على مرآة ضوء التوجيه، والسماح للمسارات الضوء على أن ربطه باستخدام موصلات الألياف البصرية.
في هذه الورقة، ونحن تصف الجمعية والمصادقة على مخطط صغير وحدات لأداء كشف مضان متعدد الألوان من خلال الاستفادة من مجموعة من الألياف البصرية لدا مكشاف ضوئي واحد (6). تقترن الألياف البصرية ليزر الفردية وإدراج طبيعية لقناة تدفق شكل حرف L في إزاحة المكانية العادية. وتوجه والألياف جمع مضان موازية للمناطق الإثارة ويرتبط إلى PMT واحد. لأن قطرات يمر عبر أشعة الليزر في أوقات مختلفة، والبيانات التي سجلتها PMT يظهر الزمنية تعويض التي تسمح للمستخدم للتمييز بين مضان المنبعثة بعد هو متحمس الحبرية كل شعاع الليزر واضح. هذا التحول الزمني يلغي الحاجة لفصل الضوء المنبعث من هذه الفرق منفصلة باستخدام سلسلة من المرايا مزدوج اللون والمرشحات ممر الموجة. للتحقق من صحة فعالية للكشف، ونحن quantitate مضان في السكان قطرة التغليف الأصباغ من لون مختلف والتركيز. تم دراسة حساسية نظام واحد كشف اللون فلوريسئين، ويظهر القدرة على الكشف عن قطرات مع تركيزات الى 0.1 نانومتر، حساسية الظهور 200Xovement بالمقارنة مع النهج الألياف مقرها الأخيرة التي أعلن عنها في الأدب 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
كشف الألياف البصرية يتطلب محاذاة الألياف البصرية فيما يتعلق قنوات السوائل. لأن لدينا جهاز يستخدم القنوات دليل ملفقة مع ضوئيه متعدد الطبقات، وضع أقنعة مع الاحترام لبعضهما البعض هو من أهمية كبيرة. إذا كانت القنوات دليل الألياف هي قريبة جدا من قناة السوائل، وهناك احتم?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
