Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Капельные микрофлюидики обеспечивают платформу для высокой пропускной способности биологии путем compartmentalizing экспериментов в большом количестве водных капелек , взвешенных в носителе масла 1. Капельки использовались для применения в качестве различных как одного клеточного анализа 2, цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) 3, и фермент эволюции 4. Флуоресцентные анализы стандартный режим обнаружения для микрофлюидики капель, так как их яркие сигналы и быстрого времени отклика совместимы с определением объемов капельные суб-nanoliter по ставкам килогерц. Многие приложения требуют обнаружения флуоресценции в течение по крайней мере двух цветов одновременно. Например, наша лаборатория обычно выполняет ПЦР-активированный капельные сортировки экспериментов , которые используют один канал обнаружения для результата анализе, и использует вторичный фон краситель , чтобы сделать тест-отрицательный капелька счетная 5.
Типичные станции обнаружения для микрофлюидики капельных являются баСЭД на эпифлуоресцентной микроскопов, и требуют сложных световых схем манипуляции, чтобы ввести свет возбуждения от свободных космических лазеров в микроскоп, чтобы быть сфокусирован на образце. После того, как флуоресценция испускается из капелькой, испускаемый флуоресцирующих свет фильтруется таким образом, чтобы каждый канал обнаружения использует один фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), завязанный на полосе длин волн. Эпифлуоресцентной микроскоп на основе оптических систем обнаружения обеспечивают барьер для выхода на рынок из-за их счет, сложности и необходимости технического обслуживания. Оптические волокна обеспечивают средства для создания упрощенной и надежной схемы обнаружения, так как волокна могут быть вручную вставлены в микрожидкостных устройств, устраняя необходимость прокладки света зеркала на основе, и позволяя легкие пути к сопрягаться с использованием волоконно-оптических соединителей.
В этой статье мы опишем сборку и проверку компактной и модульной схемы для выполнения многоцветной флуоресцентной детекции с использованием массива оптических волокон апда одиночный фотодетектор 6. Оптические волокна связаны с отдельными лазерами и вставлены нормально к форме L канала потока при регулярных пространственных смещений. Коллекция флюоресценции волокна ориентированы параллельно областей возбуждения и подключен к одному ФЭУ. Поскольку капелька проходит через лазерные лучи в разные моменты времени, данные, записанные с помощью ФЭУ показывает временное смещение, которое позволяет пользователю различать флуоресценции, испускаемой после того, как капелька возбуждается каждого отдельного лазерного луча. Этот временной сдвиг исключает необходимость разделения излучаемого света для отдельных ФЭУ с использованием ряда дихроичных зеркал и полосовых фильтров. Для того, чтобы проверить эффективность детектора, мы количественной оценки флуоресценции в популяциях капельных заключающих красители разного цвета и концентрации. Чувствительность системы исследуется для обнаружения одного цвета флуоресцеина, и показывает способность обнаруживать капли с концентрацией до 0,1 нМ, в 200х чувствительности улучшения мovement по сравнению с последними подходами волокна на основе описанных в литературе 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнаружение Оптоволоконный требует выравнивания оптических волокон относительно каналов для текучей среды. Поскольку наше устройство использует каналы программы передач изготавливаемых с многослойным фотолитографии, размещение масок по отношению друг к другу имеет большое значен…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
