Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Droplet microfluidics een platform voor high throughput biologie door compartimentering van experimenten in een groot aantal van de waterige druppeltjes gesuspendeerd in een drager olie 1. Druppeltjes zijn gebruikt voor toepassingen die variëren van eencellige analyse 2, digitale polymerasekettingreactie (PCR) 3, en enzym evolutie 4. Fluorescerende assays zijn de standaard manier van detectie voor druppel microfluidics, als hun heldere signalen en een snelle time respons verenigbaar is met het opsporen van sub-nanoliter druppel volumes bij kilohertz tarieven zijn. Veel toepassingen vereisen fluorescentiedetectie ten minste twee kleuren simultaan. Zo ons lab voert gewoonlijk PCR-geactiveerde sortering druppel experimenten die detectiekanaal gebruiken voor het resultaat van een test, en gebruikt een secundaire achtergrond kleurstof assay-negatieve druppeltje telbare 5 maken.
Typische detectie stations voor druppel microfluidics zijn based op epifluorescentie microscopen, en vereisen ingewikkelde licht manipulaties's om excitatielicht introduceren van vrije ruimte lasers in microscoop te worden gericht op het monster. Nadat fluorescentie wordt uitgezonden van een druppel, wordt het uitgezonden fluoresceerden licht gefilterd zodat elk detectie-kanaal maakt gebruik van een fotomultiplicatorbuis (PMT) gecentreerd op een golflengte band. Epifluorescentie-microscoop gebaseerde optische detectie systemen een toetredingsdrempel als gevolg van hun kosten, complexiteit en benodigde onderhoud. Optische vezels zorgen voor de middelen om een vereenvoudigde en robuuste detectie systeem te bouwen, omdat vezels handmatig in microfluïdische apparaten kunnen worden geplaatst, waardoor de noodzaak voor-spiegel op basis van licht routing, en waardoor het licht paden te worden gekoppeld met behulp van optische vezel connectoren.
In dit artikel beschrijven we de assemblage en validatie van een compact en modulair systeem ter multicolor fluorescentiedetectie te voeren door gebruik te maken van een reeks van optische vezels eenda enkele fotodetector 6. Optische vezels zijn gekoppeld met individuele lasers en worden normaal opgenomen om een L vormig stroomkanaal regelmatige ruimtelijke offsets. Een fluorescentie verzameling vezel wordt evenwijdig aan de excitatie regio en is verbonden met een PMT. Omdat een druppel passeert de laserstralen op verschillende tijdstippen, gegevens die door de PMT toont een tijdelijke offset waarmee de gebruiker onderscheid te maken tussen de uitgezonden nadat de druppel wordt opgewekt door elke afzonderlijke laserbundel fluorescentie. Deze tijdelijke verschuiving elimineert de noodzaak om uitgezonden licht te scheiden om afzonderlijke PMT's met behulp van een reeks dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters. Om de effectiviteit van de detector te valideren, kwantificeren we fluorescentie druppeltjes populaties inkapselen van kleurstoffen van verschillende kleuren en concentratie. De gevoeligheid van het systeem werd onderzocht voor een kleur fluoresceïne detectie en geeft de mogelijkheid tot druppeltjes met concentraties beneden detecteren 0,1 nM, een 200x gevoeligheid vertovement vergeleken met recente vezel gebaseerde benaderingen in de literatuur 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glasvezel detectie vereist de aanpassing van de optische vezels met betrekking tot vloeistof kanalen. Omdat onze apparaat maakt gebruik van gidskanalen gefabriceerd met multilayer fotolithografie, plaatsing van maskers met ten opzichte van elkaar is van groot belang. Indien de vezel geleidingskanalen te dicht bij het vloeistofkanaal, is er een risico van lekkage; als de gids kanalen bevinden zich te ver weg of niet goed uitgelijnd, kan de fluorescentie signaal verzameld door de detectie vezel aanzienlijk worden verminde…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
