ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
מיקרופלואידיקה אגל לתת במה ביולוגית קצב העברת נתונים גבוהה על ידי מידור ניסויים במספר רב של טיפות מימיות מרחפים מוביל שמן 1. טיפות שימשו עבור יישומים שונים כמו תא בודד ניתוח 2, תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (PCR) 3, ואת האנזים האבולוציה 4. מבחני פלורסנט הם במצב הרגיל של גילוי מיקרופלואידיקה רביב, כאותות הבהירים שלהם ועל זמן תגובה מהירה תואמים גילוי כרכי אגל משנה nanoliter בשיעורי kilohertz. יישומים רבים דורשים גילוי קרינה עבור זמנית בשני צבעים לפחות. למשל, במעבדה שלנו בדרך כלל מבצעת PCR המופעל ניסויי מיון אגל המשתמשים ערוץ זיהוי אחד על התוצאה של assay, ומשתמשת לצבוע רקע משני לעשות אגל assay שלילי 5 ספיר.
תחנות גילוי אופיינית עבור מיקרופלואידיקה אגל הם based על מיקרוסקופים epifluorescence, ודורשים מסובך תוכניות מניפולציות אור להציג אור עירור לייזרים מקום פנוי לתוך מיקרוסקופ להיות ממוקד על המדגם. לאחר הקרינה נפלטת מן אגל, האור לא זרח הנפלטים מסונן כך שכל ערוץ זיהוי מנצל צינור מכפיל אחד (PMT) התרכז להקה גל. מערכות epifluorescence זיהוי אופטי מבוסס מיקרוסקופ לספק חסם הכניסה בשל ההוצאה, מורכבותם, ונזקקו תחזוקה. סיבים אופטיים לספק את האמצעים לבנות ערכת זיהוי פשוטה וחזקה, מאז סיביים יכול להיות מוכנסים באופן ידני לתוך מכשירי microfluidic, יבטל את צורך ניתוב מבוסס אור במראה, ומאפשר נתיבי אור להתממשק באמצעות מחברי סיב אופטיים.
במאמר זה נתאר את ההרכבה והבדיקה של ערכה קומפקטית ומודולרי לבצע גילוי קרינה ססגוני ידי ניצול מערך של סיבים אופטייםדה היחיד photodetector 6. סיבים אופטיים הם מצמידים את לייזרי פרט המוכנסים נורמלים ערוץ זרימה בצורת L ב קיזוז מרחבית רגיל. סיב אוסף קרינה מכוון במקביל באזורי העירור מחובר PMT יחיד. בגלל אגל עובר דרך קרן הליזר בזמנים שונים, נתונים שרשמו PMT מראים זמני לקזז המאפשר למשתמש להבחין בין הקרינה הנפלטת לאחר האגל שמתלהב כל קרן ליזר ברורה. משמרת זמנית זו מבטלת את הצורך להפריד אור נפלט אל PMTs הנפרד באמצעות סדרה של מראות dichroic ומסנן bandpass. כדי לאמת את היעילות של הגלאי, אנו לכמת קרינה באוכלוסיות אגל encapsulating צבעים של צבע ריכוז שונה. הרגישות של המערכת הוא נחקר לגילוי והעמסת צבע אחד, ומראה את היכולת לזהות טיפות עם ריכוזים עד 0.1 ננומטר, הופעות רגישות 200xovement לעומת גישות סיבים מבוסס האחרונות מהמדווח בספרות 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי סיבים אופטיים דורש יישור של סיבים אופטיים ביחס לאפיקי נוזל. מאחר שהמכשיר שלנו מנצל ערוצי מדריך מפוברקים עם photolithography multilayer, שמה של מסכות ביחס לזה היא בעלת חשיבות רבה. אם ערוצי מדריך סיבים קרובים מדי לערוץ הנוזל, קיים פוטנציאל לדליפת נוזל; אם ערוצי המדריך ממוקמים …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
