Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Microfluídica gotículas fornecer uma plataforma em alta biologia rendimento por compartimentar experimentos em um grande número de gotículas aquosas suspensas em uma transportadora de petróleo 1. Gotas têm sido utilizados para aplicações tão variadas como a análise de células individuais 2, reacção em cadeia da polimerase digitais (PCR), 3, e 4 evolução da enzima. ensaios fluorescentes são o modo padrão de detecção para microfluídica gota, como os seus sinais luminosos e tempo de resposta rápido são compatíveis com a detecção de volumes de gotículas sub-nanolitros a taxas kilohertz. Muitas aplicações exigem a detecção de fluorescência de pelo menos duas cores em simultâneo. Por exemplo, o nosso laboratório vulgarmente PCR realiza-activada de gotículas triagem experiências que utilizam um canal de detecção para o resultado de um ensaio, e utiliza um corante de fundo secundário para fazer gota-ensaio negativo contáveis 5.
estações de detecção típicos para microfluídica gotículas são based em microscópios de epifluorescência, e exigem complicados esquemas de manipulações de luz para introduzir luz de excitação de lasers de espaço livre no microscópio a ser focada na amostra. Depois de fluorescência é emitida a partir de uma gotícula, a luz de fluorescência emitida é filtrada de modo a que cada canal de detecção utiliza um tubo fotomultiplicador (PMT) centrada sobre uma banda de comprimento de onda. sistemas de detecção óptica de epifluorescência baseado em microscópio fornecer uma barreira à entrada devido à sua custa, a complexidade ea manutenção necessária. As fibras ópticas dispõem de meios para construir um esquema de detecção simplificada e robusto, uma vez que as fibras podem ser inseridas manualmente em dispositivos de microfluidos, eliminando a necessidade de encaminhamento de luz à base de espelho, e permitindo caminhos de luz para ser interligado através de conectores de fibra óptica.
Neste trabalho, nós descrevemos a montagem e validação de um sistema compacto e modular para realizar detecção de fluorescência multicolor, utilizando uma rede de fibras ópticas de umda fotodetector única 6. As fibras ópticas são acoplados aos lasers individuais e são inseridos normal a um canal de escoamento em forma de L em deslocamentos espaciais regulares. Uma fibra de recolha de fluorescência é orientada paralelamente às regiões de excitação e é ligado a um único PMT. Uma vez que uma gotícula passa através dos feixes de laser em momentos diferentes, os dados registados pelo PMT mostra um deslocamento temporal, que permite ao utilizador fazer a distinção entre a fluorescência emitida após a gotícula é excitada por cada feixe de laser distinta. Este deslocamento temporal, elimina a necessidade de separar a luz emitida PMTs separadas utilizando uma série de espelhos dicróicos e filtros passa-banda. Para validar a eficácia do detector, que quantificar fluorescência em populações de gotículas de encapsulação de corantes de cor diferente e concentração. A sensibilidade do sistema é investigada para detecção de cor única fluoresceína, e mostra a capacidade de detectar gotículas com concentrações de até 0,1 nm, uma sensibilidade impr 200xovement quando comparado a uma fibra baseada recentes relatados na literatura 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
detecção de fibra óptica requer o alinhamento das fibras ópticas com respeito a canais de fluido. Uma vez que o nosso dispositivo utiliza canais de guia fabricadas com fotolitografia multicamada, a colocação de máscaras com relação um ao outro é de grande importância. Se os canais de guia de fibra são demasiado perto do canal de fluido, existe um potencial para a fuga de fluido; Se os canais de guia estão localizados muito longe ou desalinhado, o sinal de fluorescência recolhida pela fibra de detecção po…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
