光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
液滴マイクロフルイディクスは、キャリアオイル1に懸濁水性液滴の多数の実験を区画化することにより、高スループット生物学のためのプラットフォームを提供します。液滴は、単一細胞分析2、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（PCR）3のように変化させるような用途に使用され、進化4酵素されています。彼らの明るい信号と高速時間応答がキロヘルツのレートでサブナノリットルの液滴の体積を検出すると互換性があるとして蛍光アッセイは、液滴マイクロ流体の検出の標準モードです。多くのアプリケーションは同時に、少なくとも2色のための蛍光検出を必要とします。例えば、私たちの研究室では、一般的に、アッセイの結果を一つの検出チャネルを使用した実験をソートPCR活性化液滴を行い、アッセイ陰性滴可算5にするために、二次背景染料を使用しています。
液滴マイクロ流体のための典型的な検出局はBAです落射蛍光顕微鏡上のsed、およびサンプルに集中するために、顕微鏡に自由空間レーザからの励起光を導入するために、複雑な光の操作スキームを必要とします。蛍光を液滴から出射された後、各検出チャンネル一光電子増倍管（PMT）は、波長帯を中心に利用するように、放出された蛍光を光がフィルタリングされます。落射蛍光顕微鏡ベースの光検出システムは、それらの費用、複雑さに参入障壁を提供し、メンテナンスを必要としました。光ファイバは、ファイバが手でマイクロ流体デバイスに挿入することができるので、ミラーベースの光経路の必要性を除去し、簡略化された堅牢な検出スキームを構築する手段を提供し、光路は、光ファイバコネクタを使ってインターフェースされることを可能にします。
本稿では、光学ファイバのアレイを利用することにより、多色蛍光検出を実行するためのコンパクトなモジュラー方式の組み立てと検証を記述しますダ単一の光検出器6。光ファイバは、個々のレーザに結合され、規則的な空間的オフセットでL字型の流路に垂直に挿入されます。蛍光収集ファイバは、励起領域に平行に配向され、単一のPMTに接続されています。液滴が異なる時間にレーザービームを通過するため、PMTによって記録されたデータは一時的にそのユーザが液滴がそれぞれ別個のレーザ光により励起された後に放出される蛍光とを区別することを可能にするオフセットを示しています。この時間的なシフトは、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルタのシリーズを使用して、別個のPMTへの光を分離する必要がなくなります。検出器の有効性を検証するために、我々は、異なる色や濃度の染料をカプセル化液滴集団で蛍光を定量します。システムの感度は、単一色の蛍光検出のために調査、および0.1 nMの、200倍感度インプレッションまでの濃度で液滴を検出する能力を示してい文献7に報告され、最近の光ファイバベースの手法と比較してovement。
Protocol
Representative Results
Discussion
光ファイバ検出は、流体チャネルに対する光ファイバの位置合わせを必要とします。我々のデバイスは、多層フォトリソグラフィーで作製ガイドチャネルを利用しているので、互いに対するマスクの配置が非常に重要です。ファイバガイドチャネルは、流体チャネルに近づきすぎている場合、流体の漏れの可能性があります。ガイドチャネルが離れすぎて配置又はずれている場合、検出ファ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
