Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Microfluidique Droplet fournissent une plate – forme pour une grande biologie de débit par compartimenter expériences dans un grand nombre de gouttelettes aqueuses en suspension dans une huile de support 1. Les gouttelettes ont été utilisées pour des applications aussi variées que la simple analyse de cellules 2, la réaction en chaîne par polymérase numérique (PCR) , 3 et 4 l' évolution enzymatique. dosages fluorescents sont le mode standard de détection pour la microfluidique de gouttelettes, comme leurs signaux lumineux et temps de réponse rapide sont compatibles avec la détection de volumes de gouttelettes sous-nanolitre à taux de kilohertz. De nombreuses applications nécessitent une détection par fluorescence d'au moins deux couleurs simultanément. Par exemple, notre laboratoire effectue couramment PCR-activé expériences de gouttelettes de tri qui utilisent un canal de détection pour le résultat d'un essai, et utilise un fond de colorant secondaire pour faire test négatif gouttelettes dénombrable 5.
stations de détection typiques pour la microfluidique de gouttelettes sont based sur les microscopes à épifluorescence, et nécessitent des manipulations régimes de lumière compliqué à introduire de la lumière d'excitation des lasers d'espace libre dans un microscope à se concentrer sur l'échantillon. Après que la fluorescence est émise à partir d'une goutte, la lumière émise fluoresce est filtré de telle sorte que chaque canal de détection utilise un tube photomultiplicateur (PMT) centré sur une bande de longueur d'onde. systèmes de détection optique épifluorescence à base microscope fournissent une barrière à l'entrée en raison de leurs frais, la complexité et la nécessité d'entretien. Les fibres optiques fournissent les moyens pour construire un système de détection simplifiée et robuste, étant donné que les fibres peuvent être introduites manuellement dans des dispositifs microfluidiques, en supprimant la nécessité d'un routage de lumière intégrée au rétroviseur, et en permettant des chemins de lumière pour être interfacé avec des connecteurs à fibres optiques.
Dans cet article, nous décrivons l'assemblage et la validation d'un système compact et modulaire pour effectuer une détection de fluorescence multicolore en utilisant un réseau de fibres optiques d'unda photodétecteur unique 6. Les fibres optiques sont couplées à des lasers individuels et sont insérés perpendiculairement à un canal d'écoulement en forme de L avec des décalages spatiaux réguliers. Une fibre de collecte de fluorescence est orienté parallèlement aux régions d'excitation et est reliée à une seule PMT. Parce qu'une goutte passe à travers les faisceaux laser à des moments différents, les données enregistrées par le PMT indique un décalage temporel qui permet à l'utilisateur de faire la distinction entre la fluorescence émise après la gouttelette est excitée par chaque faisceau laser distinct. Ce décalage temporel élimine la nécessité de séparer la lumière émise à PMT séparés en utilisant une série de miroirs dichroïques et filtres passe-bande. Pour valider l'efficacité du détecteur, on quantifier la fluorescence dans les populations de gouttelettes d'encapsulation des colorants de couleur différente et la concentration. La sensibilité du système est étudiée pour la détection de couleur unique à la fluorescéine, et montre la capacité de détecter des gouttelettes ayant des concentrations jusqu'à 0,1 nm, une sensibilité impr 200xOUVEMENT par rapport à des approches à base de fibres récentes rapportées dans la littérature 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
détection de fibre optique nécessite l'alignement des fibres optiques par rapport aux canaux de fluide. Parce que notre dispositif utilise des canaux de guidage fabriqués avec photolithographie multicouche, le placement des masques par rapport à l'autre est d'une grande importance. Si les canaux de guidage des fibres sont trop proches du canal de fluide, il existe un risque de fuite de fluide; si les canaux de guidage sont situés trop loin ou mal alignée, le signal de fluorescence recueillie par la fib…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- . Lithography Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015)
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
