Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von 1 in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse 2, digitale Polymerase – Kettenreaktion (PCR) 3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution 4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren 5 zu machen.
Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden.
In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor 6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis 7 in der Literatur berichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich ver…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
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