Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas
Summary
Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.
Abstract
Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.
Introduction
Microfluídica Droplet proporcionan una plataforma para alta biología rendimiento por compartimentar experimentos en un gran número de gotitas acuosas suspendidas en un aceite portador 1. Las gotitas se han utilizado para aplicaciones tan diversas como el análisis de células individuales 2, reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR) 3, y la enzima evolución 4. ensayos fluorescentes son el modo estándar de detección para microfluidos de gotitas, ya que sus señales luminosas y tiempo de respuesta rápido son compatibles con la detección de volúmenes de gotitas sub-nanolitros a tasas kilohercios. Muchas aplicaciones requieren la detección de fluorescencia de al menos dos colores simultáneamente. Por ejemplo, nuestro laboratorio realiza comúnmente PCR activadas por la clasificación de gotitas experimentos que utilizan un canal de detección para el resultado de un ensayo, y se utiliza un colorante de fondo secundario para hacer gotita ensayo negativo contable 5.
estaciones de detección típicos para microfluidos de gotas son based en los microscopios de epifluorescencia, y requieren complicados esquemas de manipulaciones de luz para introducir luz de excitación de láseres de espacio libre en el microscopio estar centrado en la muestra. Después de fluorescencia es emitida desde una gota, la luz fluorescente emitida se filtra de modo que cada canal de detección utiliza un tubo fotomultiplicador (PMT) centrada en una banda de longitud de onda. Los sistemas de detección óptica de epifluorescencia a base de microscopio proporcionan una barrera a la entrada, debido a su costo, la complejidad y requieren mantenimiento. Las fibras ópticas proporcionan los medios para la construcción de un esquema de detección simplificada y robusta, ya que las fibras se pueden insertar manualmente en los dispositivos de microfluidos, eliminando la necesidad para el enrutamiento de la luz a base de espejo, y permitir trayectorias de la luz para ser interconectados mediante conectores de fibra óptica.
En este trabajo se describe el montaje y validación de un sistema compacto y modular para realizar la detección de fluorescencia multicolor mediante la utilización de una matriz de fibras de una ópticada fotodetector solo 6. Las fibras ópticas están acopladas a los láseres individuales y se insertan normal a un canal de flujo en forma de L en desplazamientos espaciales regulares. Una fibra de captación de fluorescencia está orientado paralelo a las regiones de excitación y está conectado a un único PMT. Debido a que una gota pasa a través de los haces de láser en diferentes momentos, los datos registrados por el PMT muestra un desplazamiento temporal que permite al usuario distinguir entre la fluorescencia emitida después de la gotita es excitado por cada haz de láser distinto. Este cambio temporal elimina la necesidad de separar la luz emitida a PMT separados utilizando una serie de espejos dicroicos y los filtros de paso de banda. Para validar la eficacia del detector, que cuantificar la fluorescencia en las poblaciones de gotitas que encapsulan tintes de diferente color y la concentración. La sensibilidad del sistema se investiga para la detección de un solo color de fluoresceína, y muestra la capacidad de detectar gotitas con concentraciones de hasta 0,1 nM, un impr sensibilidad 200xovement en comparación con los enfoques basados en fibra recientes en la literatura 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
detección de fibra óptica requiere la alineación de las fibras ópticas con respecto a los canales de fluido. Debido a que nuestro dispositivo utiliza canales de guía fabricados con múltiples capas de fotolitografía, la colocación de máscaras con respecto a la otra es de gran importancia. Si los canales de guía de la fibra son demasiado cerca del canal de fluido, existe un potencial de fugas de fluido; Si los canales de guía se encuentran demasiado lejos o mal alineados, la señal de fluorescencia recogida por…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.
Materials
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran- conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 um fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 um fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
Referencias
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