إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية
Summary
وقد وضعت لدينا مختبر بولي أكريلاميد الهلاميات المائية crosslinked-DNA، ونظام هيدروجيل دينامية، لفهم أفضل للآثار تصلب الأنسجة تحوير على وظيفة الخلية. هنا، ونحن نقدم الخطط، والأوصاف، وبروتوكولات لإعداد هذه الهلاميات المائية.
Abstract
Mechanobiology هو أحد المجالات العلمية الناشئة التي تتناول الدور الحاسم من العظة المادية في توجيه مورفولوجيا الخلايا ووظيفتها. على سبيل المثال، فإن تأثير مرونة الأنسجة على وظيفة الخلية هو أحد المجالات الرئيسية للبحوث mechanobiology بسبب تصلب الأنسجة ينظم مع المرض، والتنمية، والإصابات. المواد محاكاة الأنسجة الثابتة، أو المواد التي لا يمكن أن يغير تصلب مرة واحدة ومطلي الخلايا، وتستخدم في الغالب للتحقيق في آثار تصلب الأنسجة على وظائف الخلية. في حين أن المعلومات التي تم جمعها من الدراسات ذات قيمة ثابتة، هذه الدراسات ليست مؤشرا على الطبيعة الديناميكية لالمكروية الخلوية في الجسم الحي. أفضل لمعالجة آثار تصلب الحيوية على وظيفة الخلية، قمنا بتطوير نظام بولي أكريلاميد هيدروجيل-crosslinked الحمض النووي (DNA المواد الهلامية). على عكس ركائز الحيوية الأخرى، والمواد الهلامية الحمض النووي لديها القدرة على خفض أو زيادة في صلابة بعد التصنيع دون المحفزات. تتكون المواد الهلامية الحمض النووي DNA من crosslالأحبار التي يتم بلمرة في العمود الفقري بولي أكريلاميد. إضافة وإزالة crosslinks عبر إيصال الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل يسمح الزمانية والمكانية، والسيطرة عكسها من مرونة هلام. أظهرنا في تقارير سابقة أن التشكيل الديناميكي للمرونة هلام DNA يؤثر الليفية العصبية والسلوك. في هذا التقرير والفيديو، ونحن نقدم التخطيطي الذي يصف آليات يشابك هلام الحمض النووي وخطوة بخطوة إرشادات حول إعداد المواد الهلامية DNA.
Introduction
ركائز والدينامية هي فئتين من المواد الحيوية التي تم تطويرها لدراسة الآثار المترتبة على مرونة الأنسجة أو تصلب على وظيفة الخلية. ركائز ثابتة غير قادرة على تغيير الخواص الفيزيائية لهم بعد أنها ملفقة و / أو مرة ومطلي الخلايا. كانت بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية وثنائية الأبعاد، أول ركائز ثابتة التي تم توليفها لتحقيقات mechanobiology 5،17. المواد الهلامية السلطة الفلسطينية هي سهلة التحضير وغير مكلفة، وتنوعا، ويمكن أن تكون ملفقة مع مجموعة واسعة من معاملات الرجوعية المرنة. على الرغم من هذه المزايا التقنية تجعل PA المواد الهلامية ركيزة تطبق عادة، ركائز ثابتة لا تدل على الطبيعة الديناميكية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) والبيئة المحيطة الخلوية في الجسم الحي. على سبيل المثال، ECM يخضع التعديلات صلابة نتيجة الإصابة، والتنمية، أو المرض. ولذلك يفضل ركائز ديناميكية كنماذج الركيزة محاكاة الأنسجة في الدراسات mechanobiology <sup> 22،24،25.
العديد الاصطناعية، تم تطويرها، المواد الحيوية ثنائية الأبعاد، ثلاثية الأبعاد، ثابتة، والديناميكية الطبيعية لتقليد تصلب الأنسجة 1،3،6،16،23،26. بعض ركائز ديناميكية تتطلب الحرارة والأشعة فوق البنفسجية، تيار كهربائي، الأيونات، وتغيرات درجة الحموضة لتغيير خواصها الميكانيكية 2،4،7،8،12،15،16، ولكن يمكن تقييد هذه المحفزات الحيوية تطبيق هيدروجيل ل. بولي أكريلاميد الهلاميات المائية-crosslinked الحمض النووي (DNA المواد الهلامية) هي ركائز مرنة ثنائية الأبعاد الديناميكية. crosslinks DNA تسمح لتعديل الزمني، المكاني، وعكسها من هلام DNA صلابة بإضافة الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) إلى وسائل الإعلام أو العازلة 9-11،13،14،18،21. على عكس المواد الهلامية الديناميكية المذكورة أعلاه حيث يتم تطبيق محفزات للتعديل من مرونة، والمواد الهلامية DNA تعتمد على نشر ssDNA التطبيقية للتغيير مرونة. ولذلك، فإن سطح هلام العلوي، حيث تزرع الخلايا، هو المجال الأول التضمين لأن نسبة سو مرونة التشكيل يعتمد على سمك هلام.
المواد الهلامية DNA مماثلة لنظرائهم هلام السلطة الفلسطينية في أن لديهم العمود الفقري بولي أكريلاميد، يتم استبدال إلا أن crosslinks مكرر الأكريلاميد مع crosslinks تتكون من الحمض النووي (الشكل 1). اثنين ssDNAs (SA1 وSA2) يهجن مع حبلا crosslinker (L2) لتعويض crosslinks DNA من هلام. SA1 وSA2 يكون تسلسل المتميزة التي تحتوي على كل من تعديل Acrydite في نهاية 5'لإدراجها فعال في شبكة السلطة الفلسطينية. لإعداد المواد الهلامية، وSA1 SA2 وبلمرة فردي في العمود الفقري للسلطة الفلسطينية و، في وقت لاحق، وSA1 بلمرة وSA2 تختلط معا. L2، وcrosslinker، يضاف إلى SA1 وSA2 الخليط. تسلسل قاعدة L2 مكمل لكلا SA1 وSA2 متواليات وL2 يهجن مع SA1 بالإضافة SA2 لتشكيل crosslinks DNA. يتم تحديد الأولية، ومرونة هلام DNA من قبل كل من تركيزات L2 ويشابك (الجداول 1 </قوية> و2). DNA المواد الهلامية التي تحتوي على كميات متكافئة متساوية من L2، SA1، وSA2 هي أقسى المواد الهلامية لSA1 وSA2 هي 100٪ crosslinked بواسطة L2 (تسمى 100٪ المواد الهلامية). تركيزات أقل من L2 النتيجة في نسبة أقل من يشابك DNA، وبالتالي، والمواد الهلامية DNA ليونة. الهلام منخفضة تصل إلى 50٪ crosslinked (المعينة إلى 50٪ الهلام) تم بناؤها 9-11.
الرقم 1. هلام DNA يشابك وuncrosslinking التخطيطي 9-11،13،14،18،21 الخطوة 1: SA1 (أحمر) وSA2 (الازرق) وبلمرة فردي في العمود الفقري بولي أكريلاميد (أسود). بعد البلمرة، يتم خلط SA1 وSA2 حلول بلمرة معا. يضاف L2 (الخضراء) ويهجن مع SA1 بالإضافة SA2 لتشكيل crosslinks من هلام: الخطوة 2. الخطوة 3: R2 يهجن مع تيانه موطئ قدم من L2. الخطوة 4: التهجين موطئ قدم من R2 يدفع للحيويي من L2 من SA1 وSA2.
على عكس المواد الهلامية السلطة الفلسطينية، يمكن أن المواد الهلامية DNA تشديد وتخفيف بعد التوليف. لهذا السبب، والخلايا نمت على المواد الهلامية الحمض النووي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية صلابة. لتشديد المواد الهلامية خلايا ملتصقة، L2 يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة انخفاض نسبة المواد الهلامية لزيادة نسبة crosslinks. لتليين المواد الهلامية خلايا ملتصقة، يمكن إزالتها L2 لتقليل نسبة crosslinks 10،13،21. L2 ديه تسلسل موطئ قدم إضافي في نهاية 3'للسماح L2 لuncrosslink من SA1 وSA2 (الجدول 1). ويتم إنجاز إزالة L2 بواسطة التهجين من حبلا انعكاس دعا R2. R2 هو مكمل لكامل طول L2 ويهجن مع أول موطئ قدم L2. موطئ قدم التهجين يدفع للحيويي من L2 من SA1 وSA2، الذي يلغي تشعبي ويقلل من تصلب هلام.
في هذا التقرير و الفيديو، وتقدم خطوة بخطوة تعليمات لإعداد تشنج وتليين المواد الهلامية DNA. بينما وصفت 100٪ و 80٪ الاستعدادات هلام، هذا البروتوكول يمكن أن تكون مصممة لخلق المواد الهلامية الأخرى DNA نسب crosslinked الأولية والنهائية. بشكل عام، يتم إعداد 100٪ و 80٪ المواد الهلامية، وثبتوا على زلات الغطاء الزجاجي، بين functionalized، والمصنف مع الخلايا. يضاف L2 لوسائل الإعلام من 80٪ والمواد الهلامية وأضاف R2 إلى وسائل الإعلام من المواد الهلامية 100٪، 48 ساعة بعد الطلاء. إضافة إلى وسائل الإعلام L2 صمود 80٪ إلى 100٪ المواد الهلامية crosslinked، في حين أن إضافة R2 إلى وسائل الإعلام يلطف الهلام 100٪ إلى 80٪ crosslinked. وتتم تسمية المواد الهلامية تشديد إلى 80 → 100٪ والمواد الهلامية وتتم تسمية المواد الهلامية خففت الى 100 → 80٪ والمواد الهلامية في النص. من أجل السيطرة أو المواد الهلامية ثابتة، ssDNA تتألف من تس أو كما يتم تسليمها إلى مجموعة أخرى من 100٪ و 80٪ والمواد الهلامية. بعد مدة لا تقل عن يومين التالية مرونة التشكيل، وخلايا يمكن معالجتها وتحليلها.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within الصفحات = "دائما">الجدول 1. تسلسل قاعدة لssDNA 9-11،13،14،18،21. واستخدمت الخلوية والدراسات الميكانيكية عدة دتصاميم تشعبي ifferent لتوليد المواد الهلامية الحمض النووي مع مجموعة من الخواص الميكانيكية والدينامية. المعلمات التضمين في تصميم تشعبي هي تسلسل قاعدة وطول تسلسل أو طول تشعبي. توضح الخطوط جريئة والمائل قاعدة الاقتران بين SA1 وL2 وبين SA2 وL2، على التوالي.
| تصميم | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | ||||||
| تركيز مادة الأكريلاميد (٪) | 10 | 10 | 10 | 4 | ||||
| SA1 بالإضافة إلى تهجين SA2 L2 (٪ crosslinked) | 50 | 80 | 100 | 50 | 80 | 100 | 100 | 100 |
| <قوية> مرونة (كيلو باسكال، يعني ± SEM) | 6.6 ± 0.6 | 17.1 ± 0.8 | 29.8 ± 2.5 | 5.85 ± 0.62 | 12.67 ± 1.33 | 22.88 ± 2.77 | 25.2 ± 0.5 | 10.4 ± 0.6 |
الجدول 2. معامل يونغ (E) من المواد الهلامية DNA 9-11،13،14،18،21. تركيز مادة الأكريلاميد، نسبة تشعبي، وطول تشعبي يمكن التضمين في المواد الهلامية DNA. التصاميم 1 و 2 و 3 لها 20، 28، و 40 نقطة أساس أطوال تشعبي، على التوالي. 100٪ المواد الهلامية لجميع التصاميم لديها معاملات الرجوعية مماثلة مشيرا طول تشعبي لا يؤثر مرونة هلام. ومع ذلك، والاختلافات في تركيز مادة الأكريلاميد تغير مرونة هلام DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدرة المواد الهلامية DNA لتليين أو تشديد قبل وبعد التصاق الخلايا يجعلها نموذجا مثاليا لدراسة دور تصلب الأنسجة الحيوية على وظيفة الخلية. وقد استخدمت جميع التصاميم الثلاثة في الدراسات الميكانيكية والبيولوجية. ومع ذلك، كل التصاميم الثلاث لديها مرونة مماثلة على مختلف ا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور فرانك جيانغ، الدكتور ديفيد لين، الدكتور برنارد Yurke والدكتور عدي Chippada لمساهماتهم في تطوير التكنولوجيا هلام DNA. الدكتور نوريل Hadzimichalis، سميت شاه، كيمبرلي بيترمان، روبرت أرتير على تعليقاتهم والتعديلات من هذا المخطوط. مصادر التمويل بما في ذلك لجنة جيرسي جديد على الحبل الشوكي البحوث (جرانت # 07A-019-SCR1، NAL) ونيو جيرسي معهد العلوم العصبية (MLP). وناشري هندسة الأنسجة، الجزء ألف الإذن لطبع أرقام 2 و 4 و الحيوية للحصول على إذن لإعادة طبع الشكل 3.
Materials
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com |
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix. | |
| PBS with calcium and magnesium | Any brand. | ||
| 100X Tris-EDTA buffer (TE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com |
T9285 | |
| 10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE is a reproductive toxin. |
| 40% Acrylamide solution | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | Acrylamide is a toxin. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin. |
| 12-mm diameter round coverglass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com |
12-545-82 | |
| Norland optical adhesive 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com |
NOA72 | |
| 24-well tissue culture plate | Any brand. | ||
| Microcentrifuge tubes | Any brand. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com |
C111 or 22589 | Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure. |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize. |
| Collagen Type I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com |
13813 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive. |
| 22 X 60 cover glass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Positive-displacement pipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com |
F148504 | |
| Heat block | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| UV light source | Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury. | ||
| Thermometer | Any brand. | ||
| Nitrogen gas | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ |
NI 5.0UH-R |
References
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
- Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
- Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
- Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
- Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
- Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
- Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young’s moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
- Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
- Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
- Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
- Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
- Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
- Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
- Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
- Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
- Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
- Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).
