Подготовка ДНК-сшитый полиакриламидных гидрогелей

Summary

Наша лаборатория разработала ДНК-сшитый полиакриламид гидрогели, динамическую систему гидрогеля, чтобы лучше понять эффекты модуляции ткани жесткость на функции клеток. Здесь мы предоставляем схемы, описания и протоколы по подготовке этих гидрогели.

Abstract

Mechanobiology является новым научно область, которая рассматривается принципиально важная роль физических сигналов в направляя морфологию и функции клеток. Например, эффект эластичности тканей на функции клеток является одной из основных областей mechanobiology исследований, потому что ткани жесткость модулирует с болезнями, развития и травмы. Статические ткани имитирующие материалы или материалы, которые не могут изменить жесткость раз клетки высевают, которые преимущественно используются для изучения влияния ткани жесткости на клеточных функций. В то время как информация, собранная из статических исследований ценно, эти исследования не свидетельствуют о динамической природе сотовой микросреды в естественных условиях. Для более эффективного решения эффекты динамической жесткости на функции клеток, мы разработали ДНК-сшитый систему полиакриламидного гидрогеля (гели ДНК). В отличие от других динамических подложках, гели ДНК обладают способностью уменьшать или увеличивать в жесткости после изготовления без стимулов. Гели ДНК состоят из crossl ДНКчернила, которые полимеризуются в полиакриламидном позвоночника. Добавление и удаление сшивки через доставку одноцепочечной ДНК позволяет временные, пространственные и обратимым контроль эластичности геля. Мы показали в предыдущих докладах, что динамическая модуляция упругости геля ДНК влияет фибробластов и нейронов поведение. В этом докладе и видео, мы предоставляем схему, которая описывает гель ДНК механизмы сшивания и шаг за шагом инструкции по гелей подготовка ДНК.

Introduction

Статические и динамические субстраты две категории биоматериалов, которые были разработаны, чтобы изучить эффекты ткани эластичности или жесткости на функции клеток. Статические субстраты не в состоянии изменить свои физические свойства после того как они изготавливаются и / или раз клетки высевают. Полиакриламидные (PA) гели были первые двумерные статические субстраты, которые были синтезированы для mechanobiology исследований ^5,17. PA гели легко приготовить, недорогой, универсальный, и может быть изготовлен с широким диапазоном модулей упругости. Хотя эти технические преимущества делают PA гели с широко применяется субстрат, статические субстраты не свидетельствует о динамической природе внеклеточного матрикса (ECM) и окружающей клеточной среде в естественных условиях. Например, ECM подвергается жесткости изменения в результате травмы, развития или заболевания. Динамические субстраты поэтому выступает как ткани имитирующие моделей подложки в mechanobiology исследований <sup> 22,24,25.

Многочисленные синтетические, натуральные, двумерные, трехмерные, статические и динамические биоматериалы были разработаны, чтобы имитировать ткани жесткость ^{1,3,6,16,23,26.} Некоторые динамические субстраты требуют тепла, УФ, электрический ток, ионы, и изменения рН изменить свои механические свойства ^{2,4,7,8,12,15,16,} но эти стимулы могут ограничить био-приложение гидрогеля в. ДНК-сшитый полиакриламид гидрогели (гели ДНК) являются динамичный двухмерный упругие субстраты. Сшивки ДНК позволяют временной, пространственной, и обратимой модуляцией гель ДНК жесткости добавлением одноцепочечной ДНК (оцДНК) к средствам массовой информации или буфер ^{9-11,13,14,18,21.} В отличие от указанных выше динамических гелей, где раздражители применяются для модуляции упругости, гели ДНК основаны на диффузии прикладной оцДНК для изменения упругости. Таким образом, верхняя поверхность геля, где выращивают клетки, является первой областью модулированный так как скорость выводаF упругости модуляции зависит от толщины геля.

Гели ДНК схожи с их аналогами гель ПА в том, что они имеют полиакриламидном основу, однако бис-акриламида сшивки заменены, составленных из сшивок ДНК (рисунок 1). Два ssDNAs (SA1 и SA2) гибридизации с сшивателя нити (L2), чтобы составить сшивки ДНК в геле. SA1 и SA2 имеют различные последовательности, что и содержащие модификацию Acrydite в конце 5'для эффективного включения в сети ООПТ. Для подготовки гели, SA1 и SA2 индивидуально полимеризуется в позвоночнике Звуковая и, впоследствии, полимеризованный SA1 и SA2 смешиваются. L2, сшивающий агент, добавляют к SA1 и SA2 смеси. Последовательность оснований L2 является дополнением к обоим SA1 и SA2 последовательностей и L2 гибридизуется с SA1 SA2 плюс для формирования сшивок ДНК. Начальное, упругость гель ДНК определяется как концентрации L2 и сшивания (таблицы 1 </сильный> и 2). Гели ДНК, содержащие равные стехиометрических количеств L2, SA1, SA2 и являются армированных гели потому SA1 и SA2 100% сшитый L2 (обозначенного как 100% гелей). Более низкие концентрации L2 результате в более низкий процент сшивки ДНК и, следовательно, более мягкие гели ДНК. Гели, как низкие, как 50% сшитого (обозначены как 50% гели) были построены ^9-11.

Рис.1 гель ДНК сшивания и uncrosslinking принципиальная ^{9-11,13,14,18,21} Шаг 1:. SA1 (красный) и SA2 (синий) индивидуально полимеризуется в полиакриламидном позвоночника (черный). После полимеризации SA1 и SA2 Полимеризованные растворы смешивают вместе. Шаг 2: L2 (зеленый) добавляется и гибридизуется с SA1 SA2 плюс для формирования сшивки геля. Шаг 3: R2 гибридизуется с тон опоры из L2. Шаг 4: опоры гибридизация R2 продвигает распаковки из L2 от SA1 и SA2.

В отличие от ПА гелей, гелей ДНК могут ужесточить и смягчить после синтеза. По этой причине, клетки, выращенные на гелей ДНК могут быть подвергнуты динамических изменений жесткости. Для придания жесткости гели клеток прилипания, L2, могут быть добавлены в культуральную среду низких процентных гелей, чтобы увеличить процент сшивок. Чтобы смягчить гели клеток-единомышленником, L2 могут быть удалены, чтобы уменьшить процент сшивки ^10,13,21. L2 имеет дополнительное последовательность опоры в конце 3', чтобы позволить L2, чтобы uncrosslink от SA1 и SA2 (Таблица 1). Удаление L2 осуществляется путем гибридизации разворота нити под названием R2. R 2 является дополнением к полной длины L2 и гибридизуется с первым плацдарм L2. Опоры гибридизации продвигает распаковки из L2 от SA1 и SA2, что исключает поперечных связей и снижает жесткость геля.

В этом докладе, ивидео, шаг за шагом инструкции предназначены для подготовки жесткости и смягчения гели ДНК. В то время как 100% и 80% гель препараты описаны, этот протокол может быть адаптирована для создания гели ДНК других начальных и конечных сшитых процентах. В общем, 100% и 80% гели получают, иммобилизуют на стекло покровные стекла, функционализированные и засевали клетками. L2, добавляется в средствах массовой информации 80% гели и R2 добавляется в средствах массовой информации о 100% гелей, 48 ч после посева. Добавление L2 на носитель застывает 80% гели в 100% сшитый, в то время как добавление R2 на носитель смягчает 100% гели с 80% сшитого. Окоченевшего гели обозначены как 80 → 100% гелей и смягченные гели обозначаются как 100 → 80% гели в тексте. Для контроля или статических гелей, одноцепочечной ДНК, состоящая из Ц. или Как доставляется к другому набору 100% и 80% гелей. После не менее двух дней, следующих упругости модуляции, клетки могут быть обработаны и проанализированы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kЕЭП-together.within-страница = "всегда"> Сшивки ДНК # Основ Последовательность (опоры) Модификация Температура плавления (Т _м, ° C) Комментарии 5 '→ 3' Дизайн 1 SA1 10 GCA ССТ ТТГ C 5 'Acrydite 34,9 SA2 10 GTC AGA ATG 5 'Acrydite 23.6 L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA ГГТ GC G CTA CAC ТТГ 56 Последовательность плацдарм 10 б.п. включен. R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC ТТТ GCG ТСА GAA TGA R 2 является дополнением к L2 Дизайн 2 SA1 14 ВКТ GGC ATA GGA КТ 5 'Acrydite 46.9 SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40.2 L2 40 TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA ТГК CAC G GT TAC СТТ CAT C 65.9 Последовательность плацдарм 12 б.п. включен. R2 40 GAT GAA ГГТ AAC ВКТ GGC ATA GGA CTG ТТТ CCC AAT CAG 65.9 R 2 является дополнением к L2 Desigн 3 SA1 20 ACG GAG GTG ТАТ GCA ATG TC 5 'Acrydite 55 SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6 L2 40 TCC AGT ВКТ CCC ТАА GCA TG G ACA ТТГ CAT ACA ССТ CCG T 68.8 Опоры не входит. Управления Управления 20-40 AAA AAA (и т.д.) или ТТТ ТТТ (и т.д.)

Таблица 1 Базовые последовательности для одноцепочечной ДНК ^{9-11,13,14,18,21.} Сотовый и механические исследования использованы несколько дifferent поперечные конструкции для создания гелей ДНК с рядом статических и динамических механических свойств. Параметры модулированные в дизайне сшивки являются последовательность оснований и длина последовательности или длина сшивки. Смелые и курсивом шрифты иллюстрируют спаривание оснований между SA1 и L2, а также между SA2 и L2 соответственно.

	Дизайн
	1			2			3
Акриламид Концентрация (%)	10			10			10	4
SA1 плюс SA2 гибридизации с L2 (% сшитого)	50	80	100	50	80	100	100	100
<сильный> Эластичность (кПа, среднее ± SEM)	6.6 ± 0.6	17,1 ± 0,8	29,8 ± 2,5	5.85 ± 0.62	12.67 ± 1.33	22.88 ± 2.77	25,2 ± 0,5	10.4 ± 0.6

Таблица 2 модуль Юнга (Е) гелей ДНК ^{9-11,13,14,18,21.} Концентрации акриламида, сшивки и процент длины сшивки можно модулировать в геле ДНК. Конструкции 1, 2, и 3 имеют 20, 28, и 40 п.о. поперечных длин, соответственно. 100% гели для всех конструкций имеют аналогичные модули, указывающий сшивания длину не влияет эластичность геля. Тем не менее, вариации в концентрации акриламида изменить эластичность ДНК из геля.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся протокол от приготовления геля к обработке клеток занимает минимум шесть дней. Расчетное время для приготовления геля составляет 8 ч плюс O / N Инкубационный. Расчетное время для гель иммобилизации и отжига ДНК является 8 часов плюс O / N полоскания. Расчетное время для гель…

Representative Results

До наших исследований, клетка-ECM взаимодействия наблюдались на статических совместимых биоматериалов или на необратимых и однонаправленных динамических подложках. Эти субстраты не точно отражают динамичный характер клеточном микросреды. Наша работа сдвигает существующих техническ…

Discussion

Способность гелей ДНК, чтобы смягчить или ужесточить до и после клеточной адгезии делает их идеальным модель для изучения роли динамической жесткости ткани на функции клеток. Все три конструкции были использованы в механических и биологических исследований. Тем не менее, все три имею?…

Materials

ssDNA	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium			Any brand.
100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com	T9285
10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	93290	TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	BP14021	Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	A3678	Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	T9281	Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12-mm diameter round coverglass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com	12-545-82
				Norland optical adhesive 72	Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com	NOA72
24-well tissue culture plate			Any brand.
				Microcentrifuge tubes			Any brand.
Sulfo-SANPAH	ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com	C111 or 22589	Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	P6407	Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I	Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com	13813	Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 X 60 cover glass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	12-544-G
Positive-displacement pipette	Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com	F148504
Heat block	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	11-718
UV light source			Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer			Any brand.
Nitrogen gas	GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/	NI 5.0UH-R