DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조
Summary
본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.
Abstract
제어 공학은 세포 형태와 기능을 연출 물리적 신호의 중요한 역할을 해결하는 새로운 과학 분야이다. 조직 경화 질병, 개발 및 부상으로 변조하기 때문에 예를 들어, 세포 기능에 조직 탄성 효과는 제어 공학 연구의 중요한 영역이다. 세포가 일단 도금 강성을 변경할 수없는 고정 조직 모방 재료, 또는 재료는 주로 세포의 기능에 대한 조직의 강성의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 정적 스터디에서 수집 된 정보는 가치가 있지만, 이러한 연구는 생체 내에서 세포 미세 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 더 세포 기능에 동적 강성의 영향을 해결하기 위해, 우리는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 시스템 (DNA 젤)을 개발 하였다. 다른 동적 기판과 달리, DNA 겔이 감소 또는 자극없이 제조 후 강성도를 증가시키는 능력을 가지고있다. DNA 젤은 DNA의 crossl 구성폴리 아크릴 아미드 백본으로 중합 잉크. 추가 및 단일 가닥 DNA의 전달을 통해 가교를 제거하는 것은 시간, 공간, 겔 탄성 가역 제어 할 수 있습니다. 우리는 DNA 젤 탄성 동적 변조 섬유 아세포와 신경 세포의 행동에 영향을 미치는 것을 이전 보고서에 표시했다. 이 보고서와 비디오에서 우리는 준비 DNA 젤에서 DNA 겔 가교 메커니즘과 단계별 지침을 설명하는 회로도를 제공한다.
Introduction
정적 및 동적 기질은 세포의 기능에 조직 탄성 또는 강성의 영향을 연구하기 위해 개발 된 생체 물질의 두 가지 범주이다. 정적 기판은 세포가 도금 및 / 또는 일단 제작 된 후 물리적 속성을 변경할 수 없습니다. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔은 제어 공학 조사 5,17 위해 합성했다 제 이차원 정적 기판이었다. PA 젤은 다용도, 저렴, 쉽게 준비하고, 탄성 계수의 넓은 범위로 제조 될 수있다. 이 기술의 장점은 PA가 일반적으로 적용 기판 젤하게하지만, 정적 기판은 생체 내에서 세포 외 기질 (ECM) 및 주변 세포 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 예를 들면, ECM은 상해, 현상, 또는 질병의 결과로서 강성 변화를 겪는다. 동적 기판 따라서 제어 공학 연구에서 조직을 흉내 낸 기판 모델로 선호 <sup> 22,24,25.
수많은 합성은 자연적인, 이차원, 삼차원, 정적 및 동적 생체 재료는 티슈 1,3,6,16,23,26 강성을 모방하기 위해 개발되어왔다. 몇몇 기판들은 동적 기계적 특성을 변경 2,4,7,8,12,15,16 열, UV, 전류, 이온, 및 pH 변화를 필요로하지만, 이들 자극은 하이드로 겔의 생체 응용을 제한 할 수있다. DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 (DNA 젤)은 동적 이차원 탄성 기판이다. DNA의 가교는 미디어에 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 첨가에 의한 DNA 젤 강성, 시간, 공간, 가역적 변조 허용하거나 9-11,13,14,18,21 버퍼. 자극이 탄성 변조 적용되는 상기 동적 젤과는 달리, DNA 젤은 탄성의 변화에 대한 적용 ssDNA의의 확산에 의존하고 있습니다. 따라서 세포가 성장 상부 겔 표면은, 속도 오 때문에 변조 된 첫 번째 영역은F 탄성 변조 겔 두께에 의존한다.
DNA 젤 그러나 비스 아크릴 아미드 가교는 DNA (그림 1)으로 구성 가교로 대체됩니다, 그들은 폴리 아크릴 아미드 백본을 가지고 그 자신의 PA 젤 대응과 유사하다. 두 ssDNAs (SA1 및 SA2)가 겔의 가교 결합 된 DNA를 만드는 가교제 스트랜드 (L2)와 함께 혼성화. SA1과 SA2는 모두 PA 네트워크에 효과적으로 통합하기위한 5 '끝에 Acrydite 수정을 포함하는 별개의 시퀀스를 가지고있다. 젤, SA1과 SA2의 준비를위한 개별적으로 PA 백본으로 중합하고, 그 후, 중합 SA1과 SA2 함께 혼합된다. L2, 가교제는, SA1 및 SA2 혼합물에 첨가된다. L2의 염기 서열을 모두 SA1과 SA2에 상보적인 서열이며, L2는 DNA의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화. 초기, DNA 젤 탄력성 L2 농도 및 가교 (표 1 모두에 의해 결정된다 </strong> 및 2). SA1과 SA2가 (100 % 젤로 지정) L2에 의해 백퍼센트 가교 때문에 L2, SA1, SA2와 동등한 화학 양 론적 양을 포함하는 DNA 젤은 뻣뻣한 젤입니다. 따라서 낮은 DNA 가교의 비율과, L2에서 결과의 낮은 농도, 부드러운 DNA 젤. (50 % 젤로 지정) 50 % 가교 낮은 젤은 9-11를 구성하고있다.
도 1 DNA 겔 가교 uncrosslinking 개략적 9-11,13,14,18,21 1 단계 :. SA1 (적색)과 SA2 (청색)은 개별적으로 폴리 아크릴 아미드 백본 (흑)로 중합된다. 중합 후, SA1과 SA2 중합 솔루션은 함께 혼합. 단계 2 : L2 (녹색)을 첨가하고, 겔의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화된다. 3 단계 : R2는 t으로 하이브 리다그는 L2의 발붙일. 4 단계 : R2의 발붙일 하이브리드는 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다.
PA 젤과는 달리, DNA 젤은 완고하고 합성 한 후 부드럽게. 이러한 이유로, DNA 겔상에서 성장한 세포를 동적 강성도 변화를 실시 할 수있다. 세포 접착 성 겔 완고, L2는 가교 결합의 비율을 증가시키기 위해 낮은 퍼센트 겔 배양 배지에 첨가 될 수있다. 세포 접착 성 젤을 부드럽게하기 위해, L2는 가교 10,13,21의 비율을 감소 제거 할 수 있습니다. L2는 L2가 SA1과 SA2 (표 1)에서 uncrosslink 할 수 있도록 3 '끝에 추가 발붙일 순서가 있습니다. L2를 제거하여 R2라고 반전 가닥의 혼성화에 의해 달성된다. R2는 L2의 전체 길이에 상보과 L2의 발붙일와 제 혼성화. 발붙일 하이브리드는 가교을 제거하고 겔 강성을 감소 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다.
이 보고서에서와지시 보강 및 DNA 젤 연화의 제조에 제공되는 단계별 비디오. 100 % 및 80 % 겔 제제가 기재되어 있지만,이 프로토콜은 다른 초기 및 최종 가교 백분율 DNA 겔을 만들 맞추어 질 수있다. 일반적으로, 100 % 및 80 % 겔은, 제조되는 유리 커버 슬립 상에 고정화 된, 작용 및 세포 시드. L2는 80 %의 겔 매체에 첨가하고 R2가 100 % 겔, 도금 후 48 시간의 매체에 첨가된다. 미디어 R2의 첨가는 가교 결합 된 80 % 100 % 겔을 부드럽게하는 반면 매체 L2의 첨가는 가교 결합 된 100 % ~ 80 % 겔을 경화된다. 보강 된 겔은 80 → 100 % 젤로 지정되어 연화 겔은 텍스트의 80 → 100 % 젤 지정되어 있습니다. 제어 또는 정적 젤, ssDNA를 들어 TS 구성된 또는 100 %와 80 %의 젤의 또 다른 세트에 전달된다. 탄성 변조 다음 두 최소 일 후, 세포를 처리 및 분석 할 수있다.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within 페이지 = "항상">셀룰러 및 기계 연구 라 여러 가지 사용했다. ssDNA를 9-11,13,14,18,21 표 1 염기 서열ifferent 가교 디자인은 정적 및 동적 기계적 특성의 범위 DNA 젤을 생성합니다. 가교 디자인 변조 파라미터는 기본 시퀀스와 시퀀스 길이 또는 가교 길이이다. 굵게 및 기울임 꼴 글꼴은 SA1과 L2 사이에 각각 SA2와 L2 사이의 염기쌍을 보여줍니다.
| 디자인 | ||||||||
| 1 | 이 | 3 | ||||||
| 아크릴 아미드 농도 (%) | 10 | 10 | 10 | 4 | ||||
| SA1 플러스 L2에 하이브리드 SA2 (% 가교) | 50 | 80 | 100 | 50 | 80 | 100 | 100 | 100 |
| <강한> 탄성 (kPa의, ± SEM을 의미) | 6.6 ± 0.6 | 17.1 ± 0.8 | 29.8 ± 2.5 | 5.85 ± 0.62 | 12.67 ± 1.33 | 22.88 ± 2.77 | 25.2 ± 0.5 | 10.4 ± 0.6 |
표 2 DNA 젤 9-11,13,14,18,21. 아크릴 아마이드 농도 비율 가교 결합 및 가교 길이의 영률 (E)의 DNA 젤에서 변조 될 수있다. 디자인 1, 2, 3은 각각 20, 28, 및 40 bp의 길이가 가교. 모든 설계를위한 100 % 젤은 젤 탄력에 영향을주지 않습니다 가교 길이를 나타내는 유사한 계수가있다. 하지만, 아크릴 아마이드 농도 변화는 DNA 겔 탄성을 변경.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 겔의 능력은 연화 시키거나 세포 접착 그들에게 세포 기능의 동적 강성 조직의 역할을 연구하는 이상적인 모델을 만든다 전후 완고. 세가지 설계는 기계적 및 생물학적 연구에 사용되었다. 그러나, 모든 세 개의 디자인 가교 길이는 DNA 겔 탄성 (표 2)에 영향을주지 않는 나타내는 각종 비율로 가교 유사한 탄력성이있다. 대조적으로, 아크릴 아마이드 농도는 탄성에 영향을 미친다. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사의 말씀을 프랭크 박사 지앙 박사 데이비드 린 박사 버나드 Yurke 박사 우다이 Chippada을 DNA 겔 기술을 개발에 대한 자신의 기여에 대한; 박사 노넬 Hadzimichalis, SMIT 샤 킴벌리 피터 맨, 자신의 의견이 원고의 편집 로버트 Arter; 척수에 뉴저지위원회 연구 (그랜트 # 07A-019-SCR1, NAL)와 뉴저지 신경 과학 연구소 (MLP)을 포함하여 자금 출처; 및 조직 공학 출판사, 부품이 권한은 그림 3을 다시 인쇄 할 수있는 권한에 대한 그림 2와 그림 4와 생체 재료를 다시 인쇄 할 수.
Materials
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com |
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix. | |
| PBS with calcium and magnesium | Any brand. | ||
| 100X Tris-EDTA buffer (TE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com |
T9285 | |
| 10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE is a reproductive toxin. |
| 40% Acrylamide solution | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | Acrylamide is a toxin. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin. |
| 12-mm diameter round coverglass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com |
12-545-82 | |
| Norland optical adhesive 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com |
NOA72 | |
| 24-well tissue culture plate | Any brand. | ||
| Microcentrifuge tubes | Any brand. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com |
C111 or 22589 | Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure. |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize. |
| Collagen Type I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com |
13813 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive. |
| 22 X 60 cover glass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Positive-displacement pipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com |
F148504 | |
| Heat block | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| UV light source | Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury. | ||
| Thermometer | Any brand. | ||
| Nitrogen gas | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ |
NI 5.0UH-R |
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