הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג
Summary
המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.
Abstract
Mechanobiology הוא תחום מדעי מתפתח העוסק בתפקיד הקריטי של רמזים פיזיים בהכוונת מורפולוגיה תא ותפקוד. לדוגמא, ההשפעה של גמישות רקמות בתפקוד תא הוא אזור מרכזי של מחקר mechanobiology כי רקמות נוקשות מודולציה עם מחלה, פיתוח, ופציעה. חומרי סטטי מחקה רקמות, או חומרים שלא ניתן לשנות את קשיחות פעם תאים מצופה, המשמשים ברובה כדי לחקור את ההשפעות של רקמות נוקשות בפונקציות תא. בעוד שהמידע שנאסף ממחקרי סטטי הוא בעל ערך, מחקרים אלה אינם מעידים על האופי הדינמי של microenvironment הסלולרי in vivo. כדי לטפל טוב יותר את ההשפעות של קשיחות דינמית על תפקוד תאים, שפיתחנו מערכת crosslinked DNA הידרוג'ל polyacrylamide (ג'לים DNA). שלא כמו מצעים דינמיים אחרים, יש לי ג'לי DNA היכולת להגדיל או להקטין בקשיחות לאחר הייצור ללא גירויים. ג'לים DNA מורכב מcrossl DNAסוגי הדיו שpolymerized לתוך עמוד השדרה polyacrylamide. הוספה והסרה של crosslinks באמצעות משלוח של גדילי דנ"א יחיד מאפשרת מרחב, בזמן, ושליטה הפיכה של גמישות ג'ל. שהראינו בדוחות קודמים שאפנון דינמי של גמישות ג'ל DNA משפיע פיברובלסטים ונוירון התנהגות. בדוח זה ווידאו, אנו מספקים סכמטי המתאר את מנגנוני crosslinking ג'ל DNA והוראות צעד אחר צעד על ג'לי DNA ההכנה.
Introduction
מצעים סטטי ודינמיים שתי קטגוריות של חומרים ביולוגיים שפותחו כדי לחקור את ההשפעות של גמישות רקמות או נוקשות בתפקוד תא. מצעי סטטי אינם מסוגלים לשנות את התכונות הפיזיות שלהם אחרי שהם מפוברקים ו / או פעם תאים מצופה. Polyacrylamide ג'לים (הרשות הפלסטינית) היו מצעים הראשונים דו ממדים, סטטי שהיו מסונתזים לחקירות mechanobiology 5,17. ג'לי הרשות הפלסטינית הם קל להכנה, זול, תכליתי, והוא יכול להיות מפוברק עם מגוון רחב של moduli אלסטי. למרות יתרונות הטכניים אלה הופכים את הרשות הפלסטינית ג'לי מצע נפוץ מיושם, מצעי סטטי אינם מעידים על האופי הדינמי של מטריצת חוץ תאית (ECM) וסביבה סלולרית המקיפה in vivo. לדוגמא, ECM עובר שינויי נוקשות כתוצאה מפגיעה, פיתוח, או מחלה. מצעים דינמיים ולכן הם העדיפו כמודלים מצע מחקה רקמות במחקרי mechanobiology <sup> 22,24,25.
סינטטי רב, דו ממדי חומרים ביולוגיים טבעיים,, תלת ממדים, סטטי, ודינמיים פותחו כדי לחקות רקמות נוקשות 1,3,6,16,23,26. כמה מצעים דינמיים דורשים חום, UV, זרם חשמלי, יונים, ושינויי pH לשנות התכונות מכאניות שלהם 2,4,7,8,12,15,16, אך גירויים אלה יכולים להגביל ביו היישום של הידרוג'ל. הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide (ג'לים DNA) הם מצעי אלסטי דו ממדים דינמיים. crosslinks DNA מאפשר לאפנון מרחב, בזמן, והפיך של ג'ל DNA נוקשות על ידי תוספת של DNA חד גדילים (ssDNA) לתקשורת או חיץ 9-11,13,14,18,21. שלא כמו ג'לי הדינמי האמור שבו גירויים מוחלים לאפנון של גמישות, ג'לים DNA מסתמך על דיפוזיה של ssDNA שימושי לשינוי של גמישות. לכן, המשטח העליון ג'ל, שבו תאים גדלים, הוא האזור הראשון המווסת בגלל o השיעוראפנון גמישות f תלוי בעובי ג'ל.
ג'לי DNA דומה לעמיתיהם ג'ל הרשות שביש להם עמוד שדרה polyacrylamide, לעומת זאת crosslinks bis-acrylamide מוחלף בcrosslinks המורכב מדנ"א (איור 1). שתי ssDNAs (SA1 וSA2) להכליא עם גדיל crosslinker (L2) כדי לפצות crosslinks DNA של ג'ל. SA1 וSA2 יש רצפים שונים ששניהם מכילים שינוי Acrydite בסוף 5'להתאגדות אפקטיבית לרשת של הרשות הפלסטינית. להכנת ג'לי, SA1 וSA2 הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה של הרשות הפלסטינית ו, לאחר מכן, SA1 וSA2 polymerized מעורבבים יחד. L2, crosslinker, מתווסף לSA1 ותערובת SA2. רצף בסיס L2 הוא משלים לשני רצפי SA1 וSA2 וL2 hybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks DNA. גמישות ראשונית, ג'ל DNA נקבעה על ידי שני ריכוזי L2 וcrosslinking (לוחות 1 </strong> ו2). ג'לי DNA המכיל כמויות stoichiometric שווה של L2, SA1, וSA2 הוא ג'לי הנוקש בגלל SA1 וSA2 100% crosslinked ידי L2 (מיועד כג'לי 100%). ריכוזים נמוכים של תוצאת L2 בשיעור נמוך יותר של crosslinking DNA, ולכן, ג'לים DNA רך יותר. ג'לים נמוך כמו 50% crosslinked (מיועד כג'לי 50%) נבנה 9-11.
איור 1 crosslinking ג'ל DNA ו9-11,13,14,18,21 סכמטי uncrosslinking שלב 1:. SA1 (אדום) וSA2 (כחול) הם polymerized בנפרד לתוך עמוד השדרה polyacrylamide (שחור). לאחר פילמור, פתרונות polymerized SA1 וSA2 מעורבבים יחד. שלב 2: L2 (ירוק) הוא הוסיף וhybridizes עם SA1 בתוספת SA2 כדי ליצור את crosslinks של ג'ל. שלב 3: R2 hybridizes עם tהוא דריסת הרגל של L2. שלב 4: הכלאת דריסת רגל של R2 מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2.
שלא כמו ג'לי הרשות הפלסטינית, ג'לים DNA יכול להקשיח ולרכך לאחר סינתזה. מסיבה זו, תאים שגודל על ג'לי DNA יכולים להיות נתונה לשינויים קשיחות דינמיות. כדי להקשיח ג'לי תא חסיד, ניתן להוסיף L2 לתקשורת והתרבות של ג'לים אחוז הנמוך כדי להגדיל את האחוז של crosslinks. כדי לרכך ג'לי תא חסיד, ניתן להסיר L2 כדי להקטין את אחוז crosslinks 10,13,21. יש L2 רצף דריסת רגל נוסף בסוף 3'לאפשר L2 לuncrosslink מSA1 וSA2 (טבלת 1). הסרת L2 מושגת על ידי הכלאה של גדיל היפוך נקרא R2. R2 הוא משלים לכל אורכו של L2 וhybridizes ראשון עם דריסת רגל L2. הכלאה דריסת רגל מניעה את הרוכסן של L2 מSA1 וSA2, אשר מבטל את crosslink ומפחית את נוקשות ג'ל.
בדוח זה ו וידאו, צעד אחר צעד הוראות ניתנות להכנת התקשות וריכוך ג'לי DNA. בעוד הכנות ג'ל 100% ו80% מתוארים, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ליצור ג'לים DNA של אחוזי crosslinked הראשוניים וסופיים אחרים. באופן כללי, ג'לי 100% ו80% מוכנים, משותק על תלושי כיסוי זכוכית, פונקציונליות, וזרע עם תאים. L2 מתווסף לתקשורת של 80 ג'לי% וR2 מתווסף לתקשורת של 100 ג'לי%, 48 שעות לאחר ציפוי. התוספת של L2 לתקשורת מקשיחה 80 ג'לי% ל100% crosslinked, ואילו התוספת של R2 לתקשורת מרככת 100 ג'לי% 80% crosslinked. ג'לים התקשח יועדו כ80 → 100 ג'לי% וג'לים התרכך יועדו כ100 → 80 ג'לי% בטקסט. לשליטה או ג'לים סטטי, ssDNA בהיקף של Ts או כפי שנמסר למערכת נוספת של 100% ו80 ג'לי%. לאחר מינימום של שני ימים הבאים אפנון גמישות, יכולים להיות מעובד תאים ונותחו.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kיפ-together.within-page = "תמיד">.1 רצפי בסיס השולחן לssDNA 9-11,13,14,18,21. נייד ומחקרים מכאניים נצלו כמה דעיצובי crosslink ifferent ליצור ג'לי DNA עם מגוון רחב של תכונות מכאניות סטטי ודינמיות. הפרמטרים מווסת בעיצוב crosslink הם רצף בסיס ואורך רצף או אורך crosslink. גופנים מודגש ונטויים להמחיש זיווג בסיס בין SA1 וL2 ובין SA2 וL2, בהתאמה.
| עיצוב | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | ||||||
| ריכוז acrylamide (%) | 10 | 10 | 10 | 4 | ||||
| SA1 בתוספת SA2 הכלאה לL2 (% crosslinked) | 50 | 80 | 100 | 50 | 80 | 100 | 100 | 100 |
| <strong> אלסטיות (kPa, ממוצע ± SEM) | 6.6 ± 0.6 | 17.1 ± 0.8 | 29.8 ± 2.5 | 5.85 ± 0.62 | 12.67 ± 1.33 | 22.88 ± 2.77 | 25.2 ± 0.5 | 10.4 ± 0.6 |
לוח 2: מודול יאנג (E) של ג'לים DNA 9-11,13,14,18,21. ריכוז Acrylamide, אחוז crosslink, ואורך crosslink יכול להיות מווסת בג'לים DNA. יש עיצובים 1, 2, ו -3 20, 28, ו40 אורכי crosslink נ"ב, בהתאמה. יש לי 100 ג'לי% עבור כל העיצובים moduli דומה המצביע על אורך crosslink אינו משפיע על אלסטיות ג'ל. עם זאת, שינויים בריכוז acrylamide לשנות גמישות ג'ל DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת של ג'לי DNA כדי לרכך או להקשיח לפני ואחרי הידבקות התא הופכת אותם למודל אידיאלי כדי ללמוד את התפקיד של קשיחות רקמה דינמית על תפקוד תא. כל שלושה העיצובים שנעשו שימוש במחקרים מכאניים וביולוגיים. עם זאת, יש את כל שלושת העיצובים גמישויות דומות בשיעורי crosslink שונים, ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ל: ד"ר פרנק ג'יאנג, ד"ר דוד לין, ד"ר ברנרד Yurke וד"ר עודאי Chippada על תרומתם בפיתוח טכנולוגית ג'ל DNA; ד"ר Norell Hadzimichalis, סמיט השאה, קימברלי פיטרמן, רוברט Arter להערות והעריכות של כתב היד הזה שלהם; מקורות מימון כולל ועדת ניו ג'רזי על חוט השדרה המחקר (גרנט # 07Â-019-SCR1, מעבדת המאיץ הלאומי) וניו ג'רזי Neuroscience מכון (MLP); ומוציאים לאור של הנדסת רקמות, חלק א 'לאישור להדפיס מחדש איורים 2 ו 4 וBiomaterials רשות להדפיס מחדש את איור 3.
Materials
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com |
Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix. | |
| PBS with calcium and magnesium | Any brand. | ||
| 100X Tris-EDTA buffer (TE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com |
T9285 | |
| 10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE is a reproductive toxin. |
| 40% Acrylamide solution | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | Acrylamide is a toxin. |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin. |
| 12-mm diameter round coverglass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com |
12-545-82 | |
| Norland optical adhesive 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com |
NOA72 | |
| 24-well tissue culture plate | Any brand. | ||
| Microcentrifuge tubes | Any brand. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com |
C111 or 22589 | Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure. |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize. |
| Collagen Type I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com |
13813 | Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive. |
| 22 X 60 cover glass | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Positive-displacement pipette | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com |
F148504 | |
| Heat block | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| UV light source | Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury. | ||
| Thermometer | Any brand. | ||
| Nitrogen gas | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ |
NI 5.0UH-R |
References
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate. Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).
- Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides. Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus. J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).
- Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane. Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).
- Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions. Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses. Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel. Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).
- Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel. Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).
- Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).
- Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel. J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).
- Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. Use of rigid spherical inclusions in young’s moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels. J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).
- Luo, Y., Shoichet, M. S. Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response. Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).
- Marklein, R. A., Burdick, J. A. Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions. Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).
- Pelham Jr, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density. BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).
- Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures. J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).
- Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors. Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).
- Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels. Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).
- Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat. J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).
- Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development A growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
- Wuerfel, J., et al. Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis. Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).
- Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).
