Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Summary

O nosso laboratório desenvolveu hidrogéis de poliacrilamida reticulada-ADN, um sistema dinâmico de hidrogel, para compreender melhor os efeitos da modulação da rigidez do tecido sobre a função das células. Aqui, nós fornecemos esquemas, descrições e protocolos para preparar estes hidrogéis.

Abstract

Mechanobiology é uma área científica emergente que aborda o papel crítico de pistas físicas em dirigir a morfologia ea função das células. Por exemplo, o efeito da elasticidade do tecido em função celular é uma importante área de pesquisa por causa da rigidez do tecido mechanobiology modula com a doença, o desenvolvimento, e a lesão. Materiais imitando tecido-estática, ou materiais que não podem alterar a rigidez vez células são banhados, são predominantemente utilizados para investigar os efeitos da rigidez do tecido sobre as funções celulares. Embora as informações recolhidas a partir de estudos estáticos é valiosa, esses estudos não são indicativos da natureza dinâmica do microambiente celular in vivo. Para melhor enfrentar os efeitos da rigidez dinâmica em função das células, foi desenvolvido um sistema de poliacrilamida hidrogel reticulado-DNA (géis de DNA). Ao contrário de outros substratos dinâmicos, géis de DNA tem a capacidade de aumentar ou diminuir a rigidez após a fabricação, sem estímulos. Geles de ADN consistem de ADN crosslAs tintas que são polimerizados em uma espinha dorsal de poliacrilamida. Adição e remoção de ligações cruzadas através da entrega de DNA de fita simples permite temporais, espaciais e controle reversível da elasticidade gel. Temos demonstrado em relatórios anteriores que a modulação de elasticidade dinâmico gel DNA influencia o comportamento de fibroblastos e neurônio. Neste relatório e vídeo, nós fornecemos um esquema que descreve os mecanismos de reticulação do gel de DNA e instruções passo-a-passo sobre os géis de preparação de DNA.

Introduction

Substratos estáticos e dinâmicos são duas categorias de biomateriais que foram desenvolvidas para estudar os efeitos de elasticidade do tecido, ou em função da rigidez das células. Substratos estáticos são incapazes de alterar as suas propriedades físicas depois de serem fabricadas e / ou uma vez as células são banhados. Poliacrilamida (PA) foram os primeiros géis bidimensionais substratos, estáticas que foram sintetizadas para investigações mechanobiology ^5,17. Geles PA são fáceis de preparar, barato, versátil e pode ser fabricado com uma ampla gama de módulos elásticos. Embora essas vantagens técnicas fazem PA géis um substrato comumente aplicado, substratos estáticas não são indicativos da natureza dinâmica da matriz extracelular (MEC) e ao ambiente circundante celular in vivo. Por exemplo, a rigidez ECM sofre alterações em resultado de ferimento, de desenvolvimento, ou doença. Substratos dinâmicos são, portanto, preferidas como substratos modelo mimetizando a tecidos em estudos mechanobiology <sup> 22,24,25.

Numerosos sintético, Bidimensional biomateriais, tridimensionais, estáticos e dinâmicos naturais têm sido desenvolvidos para imitar rigidez tecidual ^{1,3,6,16,23,26.} Alguns substratos dinâmicas exigem calor, UV, corrente elétrica, os íons, e mudanças de pH de alterar as suas propriedades mecânicas ^{2,4,7,8,12,15,16,} mas esses estímulos podem restringir bio-aplicação do hidrogel. Hidrogeles de poliacrilamida reticulada-DNA (DNA) são géis elásticos substratos bidimensionais dinâmicas. Ligações cruzadas de DNA permitem a modulação temporais, espaciais, e reversível da rigidez gel DNA pela adição de DNA de fita simples (ssDNA) para mídia ou buffer ^{9-11,13,14,18,21.} Ao contrário dos géis dinâmicas acima mencionados, onde são aplicados estímulos para modulação de elasticidade, os géis de DNA contam com a difusão de ADNcs aplicada para a alteração da elasticidade. Por conseguinte, a superfície superior de gel, em que as células são cultivadas, é a primeira área modulada, porque a taxa de omodulação f elasticidade está dependente da espessura do gel.

Geles de DNA são semelhantes aos seus homólogos gel PA na medida em que têm uma espinha dorsal de poliacrilamida, no entanto, as ligações cruzadas de bis-acrilamida substituída com ligações cruzadas são compostos por ADN (Figura 1). Dois ssDNAs (SA1 e SA2) hibridar com uma cadeia reticulador (L2) para compensar as ligações cruzadas de DNA do gel. SA1 e SA2 têm seqüências distintas que ambos contêm uma modificação Acrydite no final 5 'para a incorporação efetiva na rede PA. Para a preparação do gel, SA1 e SA2 são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal PA e, subsequentemente, o SA1 polimerizada e SA2 são misturados em conjunto. L2, o agente de reticulação, é adicionado à mistura de SA1 e SA2. A sequência de bases é complementar a L2 ambas as sequências SA1 e SA2 e L2 hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas de DNA. Inicial, a elasticidade de gel de ADN é determinada por ambas as concentrações de L2 e de reticulação (Tabelas 1 </strong> e 2). Geles de ADN que contenham quantidades estequiométricas iguais de L2, AE1, AE2 e os géis são mais duras, porque SA1 e SA2 são 100% reticulado por L2 (designado como 100% de gel). Baixas concentrações do resultado L2 em uma menor percentagem de reticulação DNA e, portanto, géis de DNA mais suave. Géis tão baixas como 50% reticulado (designado como 50% de gel) ^9-11 foram construídas.

A Figura 1 de reticulação de gel do DNA e uncrosslinking esquemática ^{9-11,13,14,18,21} Etapa 1:. SA1 (vermelho) e SA2 (azul) são polimerizados, individualmente, em uma espinha dorsal de poliacrilamida (preto). Após a polimerização, as soluções polimerizados SA1 e SA2 são misturados em conjunto. Passo 2: L2 (verde) é adicionado e hibrida com SA1 mais SA2 para formar as ligações cruzadas do gel. Passo 3: R2 hibrida com tele toehold de L2. Passo 4: hibridização toehold de R2 impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2.

Ao contrário dos géis PA, géis de DNA pode endurecer e amaciar após a síntese. Por essa razão, as células cultivadas em géis de ADN pode ser submetido a alterações de rigidez dinâmica. Para endurecer géis de células aderentes, L2 pode ser adicionado ao meio de cultura de baixo géis percentuais, para aumentar a percentagem de ligações cruzadas. Para suavizar a géis de células aderentes, L2 podem ser removidas para reduzir a percentagem de ligações cruzadas ^10,13,21. L2 tem uma sequência de ponto de apoio adicional na extremidade 3 'para permitir a L2 uncrosslink de SA1 e SA2 (Tabela 1). Remoção de L2 é realizado através de hibridação de um fio chamado inversão R2. R2 é complementar ao comprimento total de L2 e hibrida com o primeiro ponto de apoio L2. Toehold hibridação impulsiona a descompactação de L2 de SA1 e SA2, que elimina a ligação transversal e reduz a rigidez do gel.

Neste relatório evídeo, passo-a-passo as instruções são fornecidas para a preparação de endurecimento e amolecimento géis de DNA. Embora 100% e de 80% as preparações de gel são descritas, este protocolo pode ser adaptada para criar ADN de géis reticulados outras percentagens iniciais e finais. Em geral, 100% e 80% de gel são preparadas, imobilizada em lamelas de vidro, funcionalizada, e semeadas com células. L2 é adicionado à media de 80% de gel e R2 é adicionado aos meios de comunicação de 100% de gel, 48 horas após o plaqueamento. A adição de meios de L2 para endurece 80% de gel de ligação cruzada a 100%, ao passo que a adição de R2 a mídia amolece a 100% de gel de 80% de ligações cruzadas. Geles endurecidos são designados como 80 → 100% de gel e geles suavizados são designados como 100 → 80% de gel no texto. Para o controlo ou géis estáticos, ADNcs ou consistindo em Ts Como é entregue a outro conjunto de 100% e 80% de gel. Depois de um mínimo de dois dias seguintes modulação elasticidade, as células podem ser processados ​​e analisados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page = "always"> Reticulação DNA # De bases Sequence (ponto de apoio) Modificação A temperatura de fusão (T _m, ° C) Comentários 5 '→ 3' Projeto 1 SA1 10 GCA CCT TTG C 5 'Acrydite 34,9 SA2 10 GTC AGA ATG A 5 'Acrydite 23,6 L2 30 TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG 56 Uma sequência de 10 pb toehold está incluído. R2 30 CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA R2 é complementar a L2 Projeto 2 SA1 14 CGT GGC ATA GGA CT 5 'Acrydite 46.9 SA2 14 GTT TCC CAA TCA GA 5 'Acrydite 40,2 L2 40 TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C 65.9 A seqüência toehold 12 bp está incluído. R2 40 GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A 65.9 R2 é complementar a L2 Design 3 SA1 20 ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC 5 'Acrydite 55 SA2 20 CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA 5 'Acrydite 56.6 L2 40 TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T 68.8 Ponto de apoio não está incluído. Controle Controle 20-40 AAA AAA (etc.) ou TTT TTT (etc.)

Tabela 1. seqüências de bases para ssDNA ^{9-11,13,14,18,21.} Celular e estudos mecânicos têm utilizado vários dmodelos de reticulação iferentes para gerar géis de ADN com uma variedade de propriedades mecânicas estáticas e dinâmicas. Os parâmetros modulados em design de reticulação são sequência de bases de comprimento e sequência ou comprimento de reticulação. Fontes em negrito e itálico ilustrar o pareamento de bases entre SA1 e L2 e entre SA2 e L2, respectivamente.

	Projeto
	1			2			3
Concentração de acrilamida (%)	10			10			10	4
SA1 mais SA2 hibridado com L2 (% reticulado)	50	80	100	50	80	100	100	100
<strong> Elasticidade (kPa, média ± SEM)	6,6 ± 0,6	17,1 ± 0,8	29,8 ± 2,5	5,85 ± 0,62	12,67 ± 1,33	22,88 ± 2,77	25,2 ± 0,5	10,4 ± 0,6

Tabela 2 o módulo de Young (E) de geles de ADN. ^{9-11,13,14,18,21} concentração de acrilamida, percentagem de ligações cruzadas, e comprimento de ligação transversal pode ser modulada em geles de ADN. Designs 1, 2 e 3 têm 20, 28 e 40 pb comprimentos de ligação transversal, respectivamente. 100% de gel para todos os projetos têm módulos semelhantes indicando comprimento reticulação não afeta a elasticidade gel. No entanto, as variações na concentração de acrilamida alterar a elasticidade em gel de ADN.

Protocol

NOTA: O protocolo inteira de preparação gel para processamento de células tem um mínimo de seis dias. Tempo estimado para preparo do gel é de 8 horas, mais um O / N incubação. Tempo estimado para imobilização gel e recozimento DNA é de 8 horas, mais uma etapa O / N enxaguar. Tempo estimado para a funcionalização gel é de 2 horas. Tempo para a galvanização e crescimento das células é dependente do tipo de cultura e de aplicação, mas é necessário um mínimo de quatro dias. 1…

Representative Results

Antes de nossos estudos, interações célula-ECM foram observados em biomateriais compatíveis estáticas ou dinâmicas em substratos irreversíveis e unidirecionais. Estes substratos não refletem com precisão a natureza dinâmica do microambiente celular. Nosso trabalho muda os paradigmas técnicos existentes, fornecendo um modelo mais fisiológico para estudar as interações célula-ECM no amolecimento e endurecimento biomateriais dinâmicos. Em estudos anteriores, foram analisados ​​os efeitos de substratos d…

Discussion

A capacidade dos geles de ADN para amolecer ou endurecer antes e após a adesão das células torna-os um modelo ideal para estudar o papel da rigidez do tecido dinâmico em função da célula. Todos os três modelos têm sido utilizados em estudos biológicos e mecânicos. No entanto, todos os três modelos têm elasticidade semelhantes em várias percentagens de reticulação, que indica o comprimento de reticulação não influenciar a elasticidade de gel do DNA (Tabela 2). Em contraste, a concentra…

Materials

ssDNA	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com		Do not vortex ssDNA. Gentle invert the vial and/or pipette solution to mix.
PBS with calcium and magnesium			Any brand.
100X Tris-EDTA buffer (TE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com	T9285
10X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	93290	TBE is a reproductive toxin.
40% Acrylamide solution	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	BP14021	Acrylamide is a toxin.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	A3678	Prepare a 2% solution in TE buffer. APS is a toxin and irratant.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	T9281	Prepare a 20% solution in TE buffer. TEMED is flammable, a corrosive, and a toxin.
12-mm diameter round coverglass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com	12-545-82
				Norland optical adhesive 72	Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com	NOA72
24-well tissue culture plate			Any brand.
				Microcentrifuge tubes			Any brand.
Sulfo-SANPAH	ProteoChem or Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com or thermofisher.com	C111 or 22589	Prepare a 0.315 mg/ml solution in water immediately before use. Dissolve at 37°C and filter sterilze. It is normal to observe undisolved sulfo-SANPAH in the filter. Sulfo-SANPAH is light sensitive and, therefore, the solution should be protect from light until UV exposure.
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)	P6407	Prepare a 0.2 mg/ml solution in water and filter sterilize.
Collagen Type I	Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com	13813	Prepare a 0.2 mg/ml solution in 0.2 N acetic acid. Solution needs to remain cold at all times to avoid polymerization. Acetic acid is a flammable, toxic, and corrosive.
22 X 60 cover glass	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	12-544-G
Positive-displacement pipette	Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com	F148504
Heat block	Fisher Scientific (Pittsburg, PA)	11-718
UV light source			Place gels as close as possible to the UV light. UV light can cause skin or eye injury.
Thermometer			Any brand.
Nitrogen gas	GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/	NI 5.0UH-R