JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

فك رموز والتصوير إمراض وحبال من<em> المتفطرة خراج</em> في الزرد الأجنة

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

المتفطرة خراج هو الممرض الناشئة التي تسبب مجموعة واسعة من متلازمات سريرية على البشر. وتشمل هذه الالتهابات الجلدية فضلا عن الالتهابات الرئوية المزمنة، واجه معظمهم في المناعة ومرضى التليف الكيسي 1،2،3،4. M. يعتبر خراج أيضا بمثابة الرئيسية الأنواع المتفطرات سريع النمو المسؤولة عن عدوى المستشفيات وعلاجي المنشأ في البشر. وعلاوة على ذلك، أبرزت عدة تقارير حديثة إمكانية أن M. خراج يمكن أن يخترق حاجز الدم في الدماغ ويحفز الآفات الهامة في النظام العصبي المركزي (CNS) 5،6. على الرغم من كونه مزارع السريع، M. المعارض خراج أيضا العديد من الميزات المسببة للأمراض التي ترتبط تلك المتفطرة السلية، بما في ذلك القدرة على الصمت لسنوات داخل الهياكل حبيبية وتوليد الآفات الجبني في الرئتين 7. أكثر إثارة للقلق هو انخفاض صنsitivity من M. خراج للمضادات الحيوية، مما يجعل هذه الإصابات صعبة للغاية لعلاج مما يؤدي إلى معدل فشل كبير العلاجية 8،9. التهديد هاما من هذا النوع هو أساسا المقاومة الجوهرية لها للمضادات الحيوية، والتي هي مصدر قلق كبير في المؤسسات الصحية العامة 10 وموانع لزرع الرئة 11.

يعرض M. خراج ناعمة (S) أو الخام morphotypes (R) مستعمرة أن تؤدي إلى نتائج سريرية مختلفة. وعلى النقيض من سلالة S، R البكتيريا لديهم ميل لتنمو اقصاه الى اقصاه، مما أدى إلى حبل أو سلك يشبه هيكل 12،13. كشفت عدة دراسات مستقلة على أساس نماذج إما الخلوية أو الحيوان النمط الظاهري فرط الفوعة للR نمط شكلي 14،15. من الدراسات الوبائية، ومعظم الحالات الشديدة من M. الالتهابات الرئوية خراج يبدو أن تترافق مع المتغيرات R 16 والتي هي البديل الوحيد الذيفقد رأينا أن تستمر لسنوات في مضيف مصاب 3. يعتمد الفرق نمط شكلي على وجود (في S) أو الخسارة (في R) من glycopeptidolipids المرتبطة السطحية (GPL) 12. ولكن نظرا إلى القيود المتأصلة في النماذج الخلوية / الحيوانية المتوفرة حاليا تستخدم لدراسة M. عدوى خراج، معرفتنا بشأن الأحداث الفيزيولوجية المرضية للمتغيرات R أو S لا تزال غامضة. إصابة الفئران المناعية المختصة عبر الطرق الوريدية أو الهباء الجوي يؤدي إلى الاستعمار عابرة، التي تعوق استخدام الفئران لدراسة الالتهابات المستمرة وللفي الجسم الحي المخدرات اختبار الحساسية 17. لذلك، وتطوير نماذج حيوانية قابلة للتلاعب استجابة المضيف يمثل تحديا كبيرا. في هذا السياق، وضعت نماذج غير الثدييات من الإصابة مؤخرا، بما في ذلك ذبابة الفاكهة 18 التي توفر العديد من المزايا مثل التكلفة والسرعة والأخلاقي القبول سVER نموذج الفأر. كما تم استكشاف نموذج الزرد (دانيو rerio) العدوى إلى تصور، من خلال التصوير غير الغازية، والتقدم والتسلسل الزمني للM. عدوى خراج في الحيوانات الحية 19. الأهم من ذلك، تم تشكيل لإثبات المفهوم أيضا لإثبات مدى صلاحيته للفي الجسم الحي تقييم المضادات الحيوية ضد M. خراج 17،20.

الزرد وقد استخدمت على نطاق واسع خلال العقدين الماضيين لدراسة التفاعلات بين مختلف مسببات الأمراض والجهاز المناعي المضيف 21. نجاح متزايد من هذا النموذج الفقاريات بديل يعتمد على فرصا كبيرة وفريدة من نوعها أن الدافع والتحقق من صحة استخدامها من أجل فهم أفضل للعديد من الالتهابات الفيروسية والبكتيرية 19،22،23،24،25،26،27،28،29. خلافا لمعظم النماذج الحيوانية الأخرى والأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح للغير الغازية مضان التصوير 30. هذا HAقاد الى دراسة M. إصابة خراج الأجنة الزرد مع تفاصيل لم يسبق لها مثيل، وبلغت ذروتها مع وصف حبال خارج الخلية، التي تمثل مثالا على اللدونة المورفولوجية البكتيرية. يمثل حبال آلية جديدة لتخريب الجهاز المناعي وآلية رئيسية تعزيز التسبب في M. الحاد عدوى خراج 19.

ويصف هذا التقرير أدوات وأساليب جديدة باستخدام الجنين الزرد إلى فك الصفات الفيزيولوجية المرضية من M. خراج العدوى ودراسة التفاعلات الحميمة بين العصيات ونظام المناعة الفطري. أولا، بروتوكول microinjection مفصل يتضمن تجهيز اللقاح البكتيري، وإعداد الجنين، والإصابة في حد ذاتها، ويرد. طرق تكييفها خصيصا لتقييم M. الفوعة خراج عن طريق قياس معايير مختلفة، مثل بقاء المضيفة وعبء البكتيرية، ترد. وقد تم التركيز على كيفيةلمراقبة، وعلى مستوى الزمانية المكانية، ومصير وتطور العدوى واستجابة المضيف المناعية للM. خراج باستخدام المجهر الفيديو. وعلاوة على ذلك، للتحقيق في مساهمة ودور الضامة خلال M. خراج العدوى، وطرق لتوليد الضامة المنضب الأجنة (باستخدام النهج إما وراثيا أو بناء كيميائيا) موصوفة. وأخيرا، وبروتوكولات لتصور التفاعلات محددة موثقة الضامة أو العدلات باستخدام الأجنة ثابتة أو المعيشة.

والهدف من هذا التقرير هو تحفيز مزيد من الدراسات لتسليط الضوء من جديد إلى M. آليات الفوعة خراج وبخاصة دور حبال في إنشاء عملية العدوى الحادة وغير المنضبط.

Protocol

الإجراءات التجريبية الزرد يجب أن تتوافق مع الأنظمة المؤسسية والحكومية ذات الصلة. لهذه الدراسة، أجريت التجارب الزرد في مونبلييه جامعة، وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحاد الأوروبي للتعامل مع الحيوانات المختبرية (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) والمعتمدة في إطار ال…

Representative Results

على الرغم من مختلف المواقع التشريحية يمكن حقن 32، وغالبا ما يتم استخدام حقن الوريد الذيلية لتوليد العدوى النظامية للتحليلات لاحقة بما في ذلك التجارب البقاء على قيد الحياة، البكتيرية تقرير عبء، والنشاط البلعمة أو تشكيل الحبل. يتم استخدام الحقن في العضلات الذيل …

Discussion

وقد ظهرت مؤخرا الزرد كنظام نموذج الفقاريات ممتازة لدراسة ديناميات عدوى بكتيرية باستخدام حقل واسع والتصوير متحد البؤر في الوقت الحقيقي 36. مزيج من تعليق المتفطرات تفرقوا (بروتوكول 2.2) جنبا إلى جنب مع أساليب الحقن الدقيقة (بروتوكول 4) يسمح التهابات استنساخه النظام…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفون ممتنون لK. كيسا للمناقشات مفيدة وتوفير يبو-clodronate وL. راماكريشنان لهدية سخية من pTEC27 وpTEC15 التي تسمح التعبير عن tdTomato واسابي، على التوالي. هذا العمل جزءا من مشاريع وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 وDIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) والبرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7-PEOPLE-2011-ITN) بموجب اتفاقية منحة لا. PITN-GA-2011-289209 لماري كوري للتدريب الأولي شبكة FishForPharma. كما نود أن نشكر جمعية غريغوري Lemarchal وVaincre لا Mucoviscidose (RF20130500835) لتمويل CM دوبونت.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/fr/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image