JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em> Mycobacterium abscessus</em> In zebravis embryo's

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus is een opkomende ziekteverwekker die een breed spectrum van klinische ziektebeelden bij de mens veroorzaakt. Deze omvatten cutane infecties alsook ernstige chronische longinfecties, meestal aangetroffen in een verzwakt immuunsysteem en bij patiënten met cystische fibrose 1,2,3,4. M. abscessus wordt ook beschouwd als een belangrijke snelgroeiende mycobacteriële species belast en iatrogene nosocomiale infecties bij mensen. Bovendien is een aantal recente rapporten gewezen op de mogelijkheid dat M. abscessus kan de bloed-hersenbarrière en induceert belangrijke laesies in het centrale zenuwstelsel (CZS) 5,6. Ondanks dat het een snelle groeier, M. abscessus vertoont ook verschillende pathogene functies die samenhangen met die van Mycobacterium tuberculosis, zoals het vermogen om te zwijgen jaren binnen granulomateuze structuren en kaasachtige laesies in de longen 7 genereren. Meer verontrustend is de lage senligheid van M. abscessus antibiotica, waardoor deze infecties zeer moeilijk te behandelen leidt tot een significant therapeutisch uitvalpercentage 8,9. Het belangrijkste gevaar van deze soort is vooral de intrinsieke resistentie tegen antibiotica, die van groot belang in openbare gezondheidsinstellingen 10 en een contra longtransplantatie 11.

M. abscessus displays glad (S) of ruwe (R) kolonie morfotypen die leiden tot verschillende klinische resultaten. In tegenstelling tot de stam S, R bacteriën de neiging om begin tot eind groeien, waardoor een touw of koord structuur 12,13. Verschillende onafhankelijke studies op basis van hetzij cellen of diermodellen bleek de hyper-virulentie fenotype van de R morfotype 14,15. Uit epidemiologische studies, de ernstigste gevallen van M. abscessus longinfecties lijken geassocieerd te zijn met R varianten 16 de enige variant dieis gezien te blijven voor de komende jaren in een geïnfecteerde gastheer 3. De morfotype verschil is gebaseerd op de aanwezigheid (in S) of verlies (in R) van oppervlakte geassocieerd glycopeptidolipids (GPL) 12. Vanwege de inherente beperkingen van de momenteel beschikbare cellulaire / diermodellen gebruikt om M. studeren abscessus infectie, onze kennis over de pathofysiologische gebeurtenissen van de R- of S-varianten blijft onduidelijk. Infectie van immuno-competente muizen via een intraveneuze of aerosol routes leidt tot kortstondige kolonisatie, belemmeren het gebruik van muizen om hardnekkige infecties en voor in vivo drug gevoeligheid testen 17 bestuderen. Daarom ontwikkelen diermodellen vatbaar voor de manipulatie van de gastheer respons is een grote uitdaging. In deze context, niet- zoogdierlijke modellen van infectie zijn recent ontwikkeld, inclusief Drosophila melanogaster 18 dat verscheidene voordelen zoals kosten, snelheid en ethische aanvaardbaarheid o aanbiedingenVER de muismodel. De zebravis (Danio rerio) model van de infectie is ook onderzocht om te visualiseren, door niet-invasieve beeldvorming, de voortgang en de chronologie van M. abscessus infectie bij een levend dier 19. Belangrijk is dat een proof of concept ook opgericht om de geschiktheid te tonen voor in vivo antibiotica assessments tegen M. abscessus 17,20.

De zebravis zijn op grote schaal gebruikt in de laatste twee decennia de interacties tussen verschillende pathogenen en immuunsysteem van de gastheer 21 bestuderen. Het toenemende succes van deze alternatieve gewervelde model is gebaseerd op de grote en unieke mogelijkheden die gemotiveerd en gevalideerd het gebruik ervan voor een beter begrip van een groot aantal virale en bacteriële infecties 19,22,23,24,25,26,27,28,29. In tegenstelling tot de meeste andere diermodellen zebravis embryo's optisch transparant, zodat niet-invasieve fluorescentiebeeldvorming 30. Deze has leidde tot M. studeren abscessus besmet zebravis embryo's met een ongekende gegevens, met als hoogtepunt de beschrijving van extracellulaire cording, dat een voorbeeld van bacteriële morfologische plasticiteit vertegenwoordigen. Cording vertegenwoordigt een nieuw mechanisme van ondermijning van het immuunsysteem en een sleutelmechanisme bevorderen pathogenese van acute M. abscessus infectie 19.

Dit rapport beschrijft de nieuwe instrumenten en methoden met behulp van de zebravis embryo naar de pathofysiologische eigenschappen van M. ontcijferen abscessus infectie en de intieme interactie tussen de bacillen en het aangeboren immuunsysteem bestuderen. Eerst wordt een gedetailleerde micro-injectie protocol dat de verwerking van het bacteriële inoculum, embryo voorbereiding en besmetting zodanig omvat, wordt gepresenteerd. Methoden specifiek aangepast aan M. beoordelen abscessus virulentie door het meten van diverse parameters, zoals de gastheer overleving en bacteriële belasting, worden gepresenteerd. Speciale aandacht wordt gegeven over hoete controleren, op een tijdruimtelijke niveau, het lot en de progressie van de infectie en de gastheer immuunrespons op M. abscessus met behulp van video-microscopie. Bovendien is de bijdrage en de rol van macrofagen tijdens M. onderzoeken abscessus infectie werkwijzen macrofagen-verarmde embryo (via genetically- of chemisch-gebaseerde aanpak) worden beschreven genereren. Tenslotte protocollen bij de specifieke interacties met macrofagen of neutrofielen met behulp van een vaste of levende embryo's worden gedocumenteerd visualiseren.

Het doel van dit rapport is om verder onderzoek te stimuleren om nieuw licht te werpen in M. abscessus virulentie mechanismen en met name de rol van cording in de oprichting van een acute en ongecontroleerde infectie proces.

Protocol

Zebravis experimentele procedures moeten voldoen aan de relevante institutionele en overheidsvoorschriften. Voor de huidige studie, werden zebravis experimenten gedaan aan de Universiteit van Montpellier, volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor de behandeling van proefdieren (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) en onder de referentie-goedgekeurde CEEA-LR-13007. 1. Bereiding van reagentia en apparatuur Microinjection Bereiden vis water door h…

Representative Results

Hoewel verschillende anatomische sites kunnen worden geïnjecteerd 32 worden staartader injecties vaak gebruikt om systemische infectie voor latere analyses, waaronder de overleving experimenten, bacteriële last vastberadenheid, fagocytose activiteit of koord formatie genereren. Injecties in de staart spieren worden gebruikt om de rekrutering van macrofagen beoordeeld op de plaats van injectie (figuur 3A). Onderzoeken en vergelijk de virulentie van R- en S varianten van M. abscessus…

Discussion

De zebravis is recentelijk naar voren gekomen als een uitstekend vertebrate modelsysteem voor het bestuderen van de dynamica van bacteriële infectie met behulp van groot veld en confocale beeldvorming in real-time 36. De combinatie van verspreide mycobacteriële schorsingen (protocol 2.2) samen met micro-injectie methoden (protocol 4) maakt reproduceerbare systemische infecties, en de daaropvolgende monitoring en visualisatie van de progressie van de infectie met een speciale focus op de bacteriële interact…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs zijn dankbaar K. Kissa voor nuttige discussies en voor het verstrekken van lipo-clodronaat en L. Ramakrishnan voor de gulle gift van pTEC27 en pTEC15 dat de expressie van tdTomato en Wasabi toe, respectievelijk. Dit werk maakt deel uit van de projecten van de Franse Nationale Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 en DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) en de Europese Gemeenschap Zevende Kaderprogramma (FP7-PEOPLE-2011-ITN) onder subsidieovereenkomst nr. PITN-GA-2011-289209 voor de Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. We willen ook de Vereniging Gregory Lemarchal en Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) bedanken voor de financiering van CM Dupont.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/fr/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image