Décrypter et de l'imagerie et la pathogenèse de Cording<em> Mycobacterium abscessus</em> Dans embryons de poissons zèbres

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus est un pathogène émergent qui provoque une large gamme de syndromes cliniques chez l'homme. Ceux-ci comprennent les infections cutanées ainsi que des infections pulmonaires chroniques sévères, principalement rencontrées dans immunodéprimés et chez les patients atteints de fibrose kystique ^1,2,3,4. M. abscessus est également considéré comme l'un des principaux espèces de mycobactéries à croissance rapide responsables des infections nosocomiales et iatrogènes chez les humains. En outre, plusieurs rapports récents ont mis en évidence la possibilité que M. abscessus pourrait traverser la barrière hémato-encéphalique et induire des lésions importantes dans le système nerveux central (SNC) ^5,6. En dépit d'être un producteur rapide, M. expositions abscessus aussi plusieurs fonctionnalités pathogènes qui sont liés à ceux de Mycobacterium tuberculosis, y compris la capacité de garder le silence pendant des années au sein des structures granulomateuses et de générer des lésions dans les poumons caséeuses ^7. Plus inquiétante est le faible sensibilité de M. abscessus aux antibiotiques, ce qui rend ces infections extrêmement difficile à traiter conduisant à un taux d'échec thérapeutique significatif ^8,9. La menace importante de cette espèce est principalement sa résistance intrinsèque à des antibiotiques, ce qui est une préoccupation majeure dans les établissements ¹⁰ de santé publique et d'une contre-indication à la transplantation pulmonaire ^11.

M. de les écrans lisses (S) ou rugueuses morphotypes (R) de la colonie qui mènent à différents résultats cliniques. A la différence de la souche S, R bactéries ont tendance à croître de bout en bout, ce qui conduit à une corde ou un cordon structure semblable à ^12,13. Plusieurs études indépendantes basées sur des modèles cellulaires ou animaux soit révélé le phénotype hyper-virulence de la R morphotype ^14,15. Des études épidémiologiques, les cas les plus graves de M. infections pulmonaires abscessus semblent être associés avec des variantes R ¹⁶ qui sont la seule variantea vu persister pendant des années dans un hôte infecté ^3. La différence de morphotype repose sur la présence (en S) ou perte (en R) de glycopeptidolipides de surface associée (GPL) ^12. Toutefois, en raison des limites inhérentes aux modèles cellulaires / animales actuellement disponibles utilisés pour étudier M. infection abscessus, nos connaissances concernant les événements physiopathologiques des variantes de R ou S reste obscure. L'infection des souris immuno-compétentes par voie intraveineuse ou en aérosol conduit à la colonisation transitoire, d'empêcher l'utilisation de souris pour étudier les infections persistantes et pour vivo tests de sensibilité dans la drogue ^17. Par conséquent, le développement de modèles animaux qui se prêtent à la manipulation de la réponse de l'hôte est un défi majeur. Dans ce contexte, les modèles non-mammifères d'infection ont été récemment mis au point, y compris Drosophila melanogaster ¹⁸ qui offre plusieurs avantages tels que le coût, la rapidité et l'acceptabilité éthique oVer le modèle de la souris. Le modèle de poisson zèbre (Danio rerio) de l'infection a également été explorée de visualiser, par imagerie non invasive, la progression et la chronologie de M. abscessus infection chez un animal en direct ^19. Surtout, une preuve de concept a également été établi pour démontrer son aptitude pour les évaluations antibiotiques in vivo contre M. abscessus ^17,20.

Le poisson zèbre ont été largement utilisés au cours des deux dernières décennies pour étudier les interactions entre les différents agents pathogènes et le système immunitaire de l'hôte ^21. Le succès croissant de ce modèle vertébré alternatif repose sur les opportunités majeurs et uniques qui ont motivé et validés son utilisation pour une meilleure compréhension de nombreuses infections virales et bactériennes ^{19,22,23,24,25,26,27,28,29.} Contrairement à la plupart des autres modèles animaux, embryons de poisson zèbre sont optiquement transparent, ce qui permet l'imagerie de fluorescence non invasive ^30. Cette has conduit à étudier M. abscessus infecté embryons de poisson zèbre avec des détails sans précédent, culminant avec la description de Cording extracellulaire, qui représentent un exemple de plasticité morphologique bactérienne. Cording représente un nouveau mécanisme de subversion du système immunitaire et un mécanisme essentiel dans la promotion pathogenèse de M. aiguë infection abscessus ^19.

Ce rapport décrit les nouveaux outils et les méthodes utilisant l'embryon de poisson zèbre à déchiffrer les traits physiopathologiques de M. abscessus infection et d'étudier les interactions intimes entre le bacille et le système immunitaire inné. Tout d'abord, la micro-injection d'un protocole détaillé qui comprend le traitement de l'inoculum bactérien, la préparation de l'embryon, et l'infection en soi, est présentée. Méthodes spécifiquement adaptés pour évaluer M. virulence abscessus par la mesure de différents paramètres, tels que la survie de l'hôte et de la charge bactérienne, sont présentés. Une attention particulière est donnée sur la façonà surveiller, à un niveau spatio-temporel, et le sort progression de l'infection et la réponse immunitaire de l'hôte à M. abscessus par microscopie vidéo. En outre, pour enquêter sur la contribution et le rôle des macrophages lors de M. abscessus infection, les méthodes pour générer des macrophages-appauvri embryons (en utilisant des approches soit génétiquement ou chimiquement base-) sont décrites. Enfin, les protocoles de visualiser les interactions spécifiques avec les macrophages ou les neutrophiles en utilisant soit des embryons fixes ou vivant sont documentés.

Le but de ce rapport est de stimuler de nouvelles études pour jeter une lumière nouvelle sur M. les mécanismes de virulence abscessus et notamment le rôle de Cording dans la mise en place d'un processus d'infection aiguë et incontrôlée.

Protocol

Procédures expérimentales de poisson zèbre doivent se conformer aux réglementations institutionnelles et gouvernementales compétentes. Pour la présente étude, les expériences de poisson zèbre ont été effectuées à l'Université de Montpellier, selon les directives de l'Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) et approuvés sous la référence CEEA-LR-13007. 1. Préparation des réac…

Representative Results

Bien que différents sites anatomiques peuvent être injectés 32, les injections de veine caudale sont souvent utilisés pour générer une infection systémique pour les analyses ultérieures, y compris les expériences de survie, la détermination de la charge bactérienne, une activité de phagocytose ou la formation du cordon. Les injections dans les muscles de la queue sont utilisés pour évaluer le recrutement des macrophages au site d'injection (figure 3A). Pour étudier et de co…

Discussion

Le poisson zèbre a récemment émergé comme un excellent système de modèle vertébré pour étudier la dynamique de l'infection bactérienne utilisant large champ et imagerie confocale en temps réel ^36. La combinaison de suspensions mycobactériennes dispersées (protocole 2.2) ainsi que les méthodes de micro-injection (protocole 4) permet infections reproductibles systémiques, et le suivi ultérieur et la visualisation de la progression de l'infection avec un accent particulier sur les interac…

Materials

BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Bovine Serum Albumin	Euromedex	04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Oleic Acid	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehyde	Delta Microscopie	15710
Phenol Red	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Low melting agarose	Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts	Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector	Tritech Research		Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Microloader Tips	Eppendorf