JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologie et infection

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em> 미코 농양</em> Zebrafish의 배아에서

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 1,2,3,4에서 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 – 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) 5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 7 caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 (10)에 관심과 폐 이식 (11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다.

M. 농양 표시 다른 임상 결과로 이어질 부드러운 (S) 또는 거친 (R) 식민지 형태 형. S 균주 달리, R 박테리아 로프 또는 끈형 구조 (12, 13)로 이어지는 단으로 성장하는 경향이있다. 세포 또는 동물 중 모델을 기반으로 여러 독립적 인 연구는 연구의 하이퍼 독성 표현형은 14, 15를 morphotype 밝혔다. 역학 연구, M.의 가장 심각한 경우 가입일 농양, 폐 감염이 연구와 관련이있는 것으로 나타납니다하는 유일한 변형 16 개의 변종이감염된 호스트 3 년 동안 지속하는 것으로 나타났습니다. morphotype 차이는 표면 관련 glycopeptidolipids (GPL) 12 (S)에 존재 또는 (R)에서 손실에 의존한다. 그러나, 현재 이용 가능한 셀룰러 / 동물 모델의 본질적인 한계는 M.에 의한 연구를 사용 농양 감염, R 또는 S 변종의 병태 생리 학적 사건에 대한 우리의 지식은 불분명 남아있다. 정맥 또는 에어로졸 경로를 통해 면역 능력이 쥐의 감염은 지속적 감염 및 생체 내 약물 감수성 검사 (17)에 대해 연구하는 마우스의 사용을 방해, 일시적 식민지로 연결됩니다. 따라서, 호스트 응답의 조작 의무가 동물 모델을 개발하는 것은 큰 도전이다. 이러한 맥락에서, 감염의 포유 동물 모델 비는 비용, 속도 및 윤리적 양호성 O 등 여러 가지 이점을 제공한다 (18)를 포함 초파리 melanogaster의 최근 개발되어왔다마우스 모델을 VER. 감염의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 모델은 또한 비 침습적 영상, M.의 진행과 연대하여, 시각적으로 탐구하고있다 살아있는 동물 19 농양 감염. 중요한 개념의 증거는 엠에 대한 생체 내 항생제 평가에 대한 적합성을 입증하기 위해 설립되었다 17, 20 농양.

제브라 널리 다양한 병원균과 숙주 면역 시스템 (21) 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어왔다. 이 다른 척추 동물 모델의 증가 성공 동기 부여 및 다수의 바이러스와 세균 감염 19,22,23,24,25,26,27,28,29의 더 나은 이해를 위해 사용을 검증 주요 독특한 기회에 의존합니다. 대부분의 다른 동물 모델에 반해, 제브라 피쉬 배아는 비 침습적 형광 이미징 (30). 이는 헥타르 있도록 광학적으로 투명M. 공부를 LED에 농양은 세균의 형태 학적 가소성의 예를 나타내는 세포 외 cording의 설명과 남중, 전례없는 세부 제브라 피쉬 배아를 감염. Cording는 면역 체계의 파괴의 새로운 메커니즘 및 급성 엠의 발병을 촉진하는 핵심 메커니즘을 나타냅니다 농양 감염 (19).

이 보고서는 M.의 병태 생리 학적 특성을 해독하는 제브라 피쉬 배아를 사용하는 새로운 도구와 방법을 설명합니다 감염 농양과 간균과 선천성 면역 시스템 사이의 친밀한 상호 작용을 연구하는. 먼저, 그 자체 박테리아 접종원 배아 준비, 감염의 처리를 포함하는 마이크로 인젝션 상세한 프로토콜이 제시된다. 구체적 방법은 M.를 평가하도록 같은 호스트의 생존과 세균 부담 등의 다양한 매개 변수를 측정하여 농양 독성이되게됩니다. 특별한 초점은 방법에 기재되어 있습니다, 시공간 수준에서, 운명과 진행 감염과 엠에 호스트 면역 반응을 모니터링 비디오 현미경을 사용하여 농양. 또한, M. 동안의 기여와 대 식세포의 역할을 조사하기 위해 감염 농양, 방법 (genetically- 또는 화학적 기반 중 하나 방법을 사용) 대 식세포가 고갈 된 배아 설명되어 있습니다를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 고정 또는 생활 배아를 사용하여 대 식세포 나 호중구가 문서화와 특정 상호 작용을 시각화합니다.

이 보고서의 목적은 엠에 새로운 광명을 비춰하는 추가 연구를 자극하는 것입니다 농양 독성 메커니즘 및 제어되지 않은 급성 감염 프로세스의 확립에 cording 특히 역할.

Protocol

Zebrafish의 실험 절차는 관련 기관 및 정부 규정을 준수해야합니다. 본 연구를 위해, 제브라 피쉬 실험은 실험 동물의 처리를위한 유럽 연합 (EU) 지침에 따라, 대학 몽펠리에에서 (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)을 수행하고, 기준에 따라 승인 CEEA-LR-13007. 시약 및 미세 주입 장비 1. 준비 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 저장 (20 분 동안 120 ° C)를 소독하기 위…

Representative Results

다양한 해부학 적 부위 (32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁?…

Discussion

제브라 피쉬는 최근 실시간 (36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 도움이 토론에 대한 각각 tdTomato와 사비의 발현을 허용 pTEC27과 pTEC15의 관대 한 선물을 사러 – 클로드과 L. 라마 크리슈를 제공하는 케이 Kissa에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 기관의 프로젝트 (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009과 DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) 및 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의이 작품의 일부를 형성 (FP7-사람들-2011-ITN) 부여 계약에 따라 NO. PITN-GA-2011-289209 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 FishForPharma합니다. 우리는 CM 듀폰에 자금을 지원하기위한 협회 그레고리 Lemarchal 및 Vaincre 라 Mucoviscidose (RF20130500835)을 감사하는 것이 좋겠다.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
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References

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
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