JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Расшифровка и визуализации патогенез и запи-<em> Микобактерии abscessus</em> У эмбрионов данио рерио

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus является новым патогеном, который вызывает широкий спектр клинических синдромов у человека. Они включают в себя кожные инфекции, а также тяжелые хронические легочные инфекции, в основном, с которыми сталкиваются в ослабленным иммунитетом и при муковисцидозе пациентов 1,2,3,4. М. abscessus также рассматривается в качестве основного быстрорастущих видов микобактерий, ответственных за внутрибольничными инфекциями и ятрогенных в людях. Кроме того, несколько последних докладах подчеркивается возможность, что М. abscessus может пересечь гематоэнцефалический барьер и вызывают важные поражений в центральной нервной системе (ЦНС) 5,6. Несмотря на то, быстрое садовод, М. abscessus экспонаты также несколько патогенных особенности, связанные с тем, микобактерий туберкулеза, в том числе способность хранить молчание в течение многих лет в гранулематозных структур и генерировать казеозной поражений в легких. 7 Еще более тревожным является низкая сенательность М. abscessus к антибиотикам, что делает чрезвычайно трудным для лечения приводит к значительному терапевтическому отказов 8,9 эти инфекции. Важно угроза этого вида, в основном, его внутреннее сопротивление к антибиотикам, что серьезную озабоченность в учреждениях здравоохранения 10 и противопоказания к трансплантации легких 11.

M. abscessus отображает гладкие (S) или грубой (R) колонии морфотипов, которые приводят к различным результатам. Клинических В отличие от штамма S, R бактерии имеют тенденцию к росту конца в конец, что приводит к тросу или шнура, как структура, 12,13. Несколько независимых исследований, основанных на клеточных либо или животных моделей выявлены гипер-вирулентность фенотип R морфотипом 14,15. Из эпидемиологических исследований, наиболее тяжелых случаях М. abscessus легочные инфекции, кажется, связаны с R варианты 16, которые только что вариантБыло видно, чтобы сохраняться в течение многих лет в инфицированном 3. Разница морфотип полагается на наличие (в S) или убыток (в R) поверхностно-связанный glycopeptidolipids (GPL) 12. Тем не менее, из-за ограничений, присущих имеющихся в настоящее время моделей сотовых / животных используются для изучения М. abscessus инфекция, наши знания о патофизиологических событий в R или S вариантов остается неясным. Заражение иммунокомпетентных мышей с помощью внутривенных или аэрозольных маршрутов приводит к транзиторной колонизации, препятствуя использованию мышей для изучения стойких инфекций и для в естественных условиях лекарственной чувствительности тестирования 17. Таким образом, разработка моделей животных поддающиеся манипуляции принимающей ответ является серьезной проблемой. В этом контексте модели не млекопитающих инфекции были разработаны недавно, в том числе дрозофилы 18, который предлагает несколько преимуществ, таких как стоимости, скорости и этическую приемлемость OVer модель мыши. Данио (Danio rerio) модель инфекции также были изучены для визуализации, по неинвазивной визуализации, прогрессии и хронологии М. abscessus инфекции в живого животного 19. Важно отметить, что доказательство концепции было также установлено, чтобы продемонстрировать свою пригодность для естественных антибиотиков в оценках против М. abscessus 17,20.

Данио были широко используется в течение последних двух десятилетий, чтобы изучить взаимодействие между различными возбудителями и иммунной системы хозяина 21. Увеличение Успех этой альтернативной модели позвоночных опирается на крупных и уникальных возможностей, которые мотивированы и проверенных использовать его для лучшего понимания многочисленных вирусных и бактериальных инфекций 19,22,23,24,25,26,27,28,29. В отличие от большинства других животных моделях, эмбрионы рыбок данио оптически прозрачны, что позволяет неинвазивным флуоресценции изображений 30. Это гаы привело к изучению М. abscessus инфицированных эмбрионов данио с беспрецедентными деталей, кульминацией с описанием внеклеточного Перетяжка, которые представляют пример бактериальной морфологической пластичности. Кординг представляет собой новый механизм подрывной деятельности иммунной системы и ключевую механизм, способствующий патогенеза острого М. abscessus инфекции 19.

Этот отчет описывает новые инструменты и методы, используя данио эмбриона, чтобы расшифровать патофизиологические черты М. abscessus инфекции и изучать интимные взаимодействия между бацилл и иммунной системы. Во-первых, Подробный протокол микроинъекции, который включает обработку бактериального инокулята, подготовки эмбриона, и инфекции как таковой, представлена. Методы адаптирован для оценки M. abscessus вирулентности путем измерения различных параметров, таких как выживание хозяина и бактериальной нагрузки, представлены. Особое внимание уделяется, какконтролировать, в пространственно-временном уровне, судьбу и развитие инфекции и иммунного ответа к М. abscessus с использованием видео-микроскопии. Кроме того, для изучения вклада и роли макрофагов при М. abscessus инфекции, методы получения макрофаги обедненного эмбрионов (используя либо genetically- или химически основе подходов), описанные. Наконец, протоколы для визуализации конкретных взаимодействия с макрофагами или нейтрофилами, используя фиксированные или живущих эмбрионов документально.

Целью данного отчета является стимулирование дальнейших исследований, чтобы пролить новый свет на М. abscessus механизмы вирулентности и, в частности роль сь в создании острого и неконтролируемой инфекции. процесса

Protocol

Рыбок данио экспериментальные процедуры должны соответствовать соответствующих институциональных и правительственных постановлений. Для настоящего исследования, данио эксперименты были проведены в университете Монпелье, в соответствии с директивами Европейского Союза для обрабо…

Representative Results

Хотя различные анатомические участки могут быть введены 32, хвостовой вены инъекции часто используется для генерации системной инфекции для последующих анализов в том числе экспериментов выживания, определение бактериального бремени, фагоцитоза деятельности или формирования ?…

Discussion

Данио недавно появились в качестве отличной позвоночных модельной системы для изучения динамики бактериальной инфекции с помощью широкое поле и конфокальной микроскопии в режиме реального времени 36. Сочетание дисперсных микобактерий суспензий (протокол 2.2) вместе с методами м?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарны К. Kissa за полезные обсуждения и для обеспечения Липо-клодронат и Л. Ramakrishnan для щедрый дар pTEC27 и pTEC15, что позволит выражение tdTomato и Васаби, соответственно. Эта работа является частью проектов Национального агентства исследований Франции (ANR ZebraFlam-10-MIDI-009 и DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) и Седьмой рамочной программе Европейского Сообщества (FP7-PEOPLE-2011-ITN) под грантового соглашения нет. PITN-ГА-2011-289209 для Мари Кюри Начальное обучение сети FishForPharma. Мы хотели бы также поблагодарить ассоциации Лемаршаль и Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) для финансирования CM Дюпона.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/fr/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image