JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em> Mycobacterium abscessus</em> Zebra balığı Embriyolar

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus insanlarda klinik sendromların çok geniş bir yelpaze neden olan bir yükselen bir patojendir. Bunlar deri enfeksiyonları gibi ciddi kronik akciğer enfeksiyonları, çoğunlukla bağışıklık sistemi baskılanmış ve kistik fibroz hastalarında 1,2,3,4 karşılaşılan sayılabilir. M. abscessus insanlarda da, hastane ve iatrojenik enfeksiyonlara yol açan önemli bir hızla büyüyen bir mikrobakteriyel tür olarak kabul edilir. Dahası, birçok yeni raporlar imkanı vurgulanan M. abscessus, kan-beyin bariyerini geçer ve merkezi sinir sistemi (MSS) 5,6 önemli lezyonlar tetikleyebilir. Hızlı bir yetiştiriciye, M. olmasına rağmen Ayrıca abscessus sergiler granülomatöz yapılar içinde yıllarca sessiz kalmayı ve akciğerlerde 7 kazeöz lezyonlar oluşturmak için kapasitesi de dahil olmak Mycobacterium tuberculosis olanlar ilişkili birkaç patojenik özellikleri. Daha endişe verici düşük sen olduğunuM. duyarlılık antibiyotiklere abscessus, önemli terapötik başarısızlık oranı 8,9 giden tedavisi son derece zordur bu enfeksiyonların render. Bu türün önemli bir tehdit esas önemli bir halk sağlığı kurumlarına 10 kaygı ve akciğer nakli 11 kontrendike biridir antibiyotik olan içsel direnç olduğunu.

M. abscessus görüntüler farklı klinik sonuçlara yol düz (S) veya pürüzlü (R) koloni morfotipler. S suşu aksine, R bakteriler bir ip ya da kordon benzeri yapı 12,13 giden, uçtan uca büyümesi için bir eğilim vardır. Hücresel veya hayvan ya modellere dayalı birkaç bağımsız çalışmalar R hiper-virülans fenotip 14,15 Morfotip saptandı. Epidemiyolojik çalışmaların, M. en şiddetli vakalarından abscessus akciğer enfeksiyonları R ile ilişkili olduğu görünen tek varyant olan 16 varyantları olduğunuenfekte olmuş bir konukçu 3 yıl için kalıcı olduğu görülmüştür. Morfotip farkı yüzeyi ile ilişkili glycopeptidolipids (GPL) 12 (S) varlığında veya (R) zarara dayanır. Ancak, mevcut hücresel / hayvan modellerinin doğal sınırlamalar nedeniyle M. incelemek için kullanılan abscessus enfeksiyon, R veya S varyantları patofizyolojik olaylarla ilgili bilgimiz belirsiz kalır. Intravenöz veya aerosol yollardan bağışıklık yetkili farelerin Enfeksiyon kalıcı enfeksiyonları ve in vivo ilaç duyarlılık testi 17 için çalışma farelerin kullanımını engelleyen, geçici kolonizasyon yol açar. Bu nedenle, konak yanıtının manipülasyon için uygun hayvan modelleri geliştirmek önemli bir sorundur. Bu bağlamda, enfeksiyonun memeli olmayan model, bu gibi maliyet, hız ve etik kabul edilebilirliği o gibi birçok avantaj sunar 18 melanogaster Drosophila da dahil olmak üzere, son zamanlarda geliştirilmiştirfare modelini VER. Enfeksiyon Zebra balığı (Danio rerio) modeli aynı zamanda non-invaziv görüntüleme, M. ilerlemesi ve kronolojisi tarafından, görselleştirmek için araştırılmaktadır Canlı bir hayvanda 19 abscessus enfeksiyon. Önemlisi, kavramın bir kanıtı da M. karşı in vivo antibiyotik değerlendirmeleri için uygunluğu göstermek için kurulmuştur 17,20 abscessus.

Zebra balığı çok çeşitli patojenler ve konak bağışıklık sistemi 21 arasındaki etkileşimleri incelemek için son yirmi yılda kullanılmaktadır. Bu alternatif omurgalı modelin artan başarısı motive ve çok sayıda viral ve bakteriyel enfeksiyonlar 19,22,23,24,25,26,27,28,29 daha iyi anlaşılması için kullanılmasını valide büyük ve eşsiz fırsatlar dayanır. Diğer birçok hayvan modellerinde farklı olarak, zebra balığı embriyolar invazif olmayan flüoresan görüntüleme 30. Bu ha sağlayan optik olarak saydamdır,M. çalışmaya yol açtı s abscessus bakteriyel morfolojik plastisite bir örnek temsil dışı Cording açıklaması ile sonuçlanan, görülmemiş detaylarla zebrafish embriyolar bulaşmış. Cording bağışıklık sisteminin devirmenin yeni bir mekanizma ve akut M. patogenezi teşvik eden bir kilit mekanizmasını temsil eder abscessus enfeksiyon 19.

Bu rapor M. patofizyolojik özellikleri deşifre Zebra balığı embriyo kullanarak yeni araçlar ve yöntemleri açıklar enfeksiyon abscessus ve basil ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasında yakın etkileşimleri çalışmak için. İlk olarak, haddi zatında bakteriyel inokulum, embriyo hazırlanması ve enfeksiyon işlenmesini içeren detaylı mikroenjeksiyon protokolü sunulmaktadır. Yöntem özellikle M. değerlendirmek üzere uyarlanmış Böyle ev sahibi hayatta kalma ve bakteriyel yükü gibi çeşitli parametreler, ölçerek abscessus virulans sunulmuştur. Özel odak nasıl verilirBir zamanmekansal düzeyde, kader ve ilerlemesini enfeksiyon ve M. konak immün yanıtı izlemek için Video mikroskopi kullanılarak abscessus. Dahası, M. sırasında katkı ve makrofajlar rolünü araştırmak için enfeksiyon abscessus, yöntem (Genetik olarak ya da kimyasal olarak tabanlı ya da yaklaşımlar kullanılarak) makrofajlar tükenmiş embriyolar açıklanmıştır üretir. Son olarak, protokoller sabit veya canlı embriyolar kullanarak makrofajlar veya nötrofiller belgelenmiştir belirli etkileşimleri görselleştirmek için.

Bu raporun amacı, M. yeni ışık tutacak ileri çalışmalar teşvik etmektir abscessus virülans mekanizmaları ve akut ve kontrolsüz enfeksiyon sürecinin kuruluşunda Cording özellikle rolü.

Protocol

Zebra balığı deneysel esaslar ilgili kurum ve devlet düzenlemelere uymak zorundadır. Mevcut çalışmada, zebrabalıkları deneyler laboratuar hayvanlarının kullanımı için, Avrupa Birliği kurallarına göre, Üniversite Montpellier (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) yapıldı ve referansı kapsamında onaylanan CEEA-LR-13007. Reaktifler ve Mikroenjeksiyon Ekipman 1. Hazırlık Sonra yukarı 1 ay 28.5 ° C ve mağaza (20 dakika boyunca 12…

Representative Results

Çeşitli anatomik yerler 32 enjekte edilebilir, ancak, kuyruk damarı enjeksiyonu genellikle sağkalım deneylerde bakteriyel yük belirleme, fagositoz aktivitesi veya kordon oluşumu da dahil olmak üzere daha sonraki analizler için sistemik bir enfeksiyon elde etmek için kullanılır. Kuyruk kaslarda Enjeksiyonlar Enjeksiyon (Şekil 3A) yerinde makrofajların işe değerlendirmek için kullanılır. Araştırmak ve M. R ve S varyantları virülansını karşılaştırmak abs…

Discussion

Zebra balığı son gerçek zamanlı 36 geniş bir alan ve konfokal görüntüleme kullanılarak bakteriyel enfeksiyon dinamiklerini incelemek için mükemmel bir omurgalı bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Birlikte mikro-enjeksiyon yöntemleri (protokol 4) ile dağınık mikobakteriyel süspansiyonlar (protokol 2.2) kombinasyonu tekrarlanabilir sistemik enfeksiyonlar ve daha sonraki izleme ve ev sahibi makrofajlar ile bakteriyel etkileşimleri üzerine özel bir odaklanma ile enfeksiyonun ilerle…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar yararlı tartışmalar için sırasıyla, tdTomato ve Wasabi ifadesini sağlayan pTEC27 ve pTEC15 cömert hediye için lipo-klodronat ve L. Ramakrishnan sağlamak için K. Kissa minnettarız. Fransız Ulusal Araştırma Ajansı projelerinden (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 ve DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) ve Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı Bu çalışma parçasını oluşturmaktadır (FP7-PEOPLE-2011-ITN) Hibe sözleşmesi kapsamında hayır. PITN-GA-2011-289209 Marie-Curie İlk Eğitim Ağı FishForPharma için. Biz CM Dupont fon Derneği Gregory Lemarchal ve Vaincre La mukoviskidoz (RF20130500835) teşekkür etmek de isterdim.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/fr/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image