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Immunologie et infection

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em> Mycobacterium abscessus</em> In Zebrafischembryonen

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus ist eine aufstrebende Erreger, die ein breites Spektrum von Krankheitsbildern in den Menschen verursacht. Dazu gehören Hautinfektionen sowie schwere chronische Lungeninfektionen, vor allem bei immungeschwächten und Fibrose-Patienten 1,2,3,4 zystische aufgetreten. M. abscessus wird auch als Haupt schnell wachsenden Mykobakterienarten für nosokomiale und iatrogene Infektionen beim Menschen verantwortlich gemacht. Darüber hinaus hob mehrere jüngsten Berichten die Möglichkeit, daß M. abscessus kann die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und induzieren wichtig Läsionen im zentralen Nervensystem (CNS) 5,6. Obwohl er eine schnelle Bauer, M. abscessus Exponaten auch einige pathogene Eigenschaften, die denen von Mycobacterium tuberculosis verwandt sind, einschließlich der Fähigkeit, schwieg Jahren innerhalb granulomatöse Strukturen bleiben und käsige Läsionen in der Lunge 7 zu erzeugen. Noch alarmierender ist die geringe senlichkeit von M. abscessus gegen Antibiotika, wodurch diese Infektionen extrem schwierig zu behandeln, die zu einer signifikanten therapeutischen Ausfallrate 8,9. Die wichtige Bedrohung dieser Art ist vor allem seiner intrinsischen Resistenz gegen Antibiotika, die zu großer Besorgnis in der öffentlichen Gesundheitseinrichtungen 10 und einer Kontraindikation für eine Lungentransplantation 11 ist.

M. abscessus Displays glatt (S) oder rauhe (R) Kolonie Morphotypen, die unterschiedlichen klinischen Ergebnissen führen. Im Gegensatz zu dem S-Stamm haben R Bakterien eine Tendenz zu einem Ende zum anderen zunehmen, was zu einem Seil oder schnurartigen Struktur 12,13. Mehrere unabhängige Studien, die entweder auf Zell- oder Tiermodellen ergeben, die hyper-Virulenz Phänotyp der R Morphotyp 14,15. Aus epidemiologischen Studien, den schwersten Fällen von M. abscessus Lungeninfektionen scheinen mit R verbunden sein Varianten 16, die die einzige Variante ist, dasshat sich gezeigt, für viele Jahre in einem infizierten Wirt 3 bestehen. Die Morphotyp Unterschied beruht auf der Gegenwart (in s) oder Verlust (in F) des oberflächenassoziierten glycopeptidolipids (GPL) 12. Jedoch aufgrund der inhärenten Beschränkungen der derzeit verfügbaren zellularen / Tiermodelle verwendet, um M. studieren abscessus Infektion bleibt unser Wissen über die pathophysiologischen Ereignisse der R- oder S-Varianten im Dunkeln. Die Infektion von immunkompetenten Mäusen durch intravenöse oder Aerosol-Routen führt zu vorübergehenden Kolonisierung, behindern die Verwendung von Mäusen zu persistenten Infektionen und für die in vivo Arzneimittelempfindlichkeitsprüfung 17 zu studieren. Daher ist die Entwicklung von Tiermodellen offen für die Manipulation der Wirtsantwort ist eine große Herausforderung. In diesem Zusammenhang haben die Nicht-Säugetiermodellen der Infektion vor kurzem entwickelt worden, einschließlich Drosophila melanogaster 18, die mehrere Vorteile, wie beispielsweise Kosten, Geschwindigkeit und ethischen Akzeptanz o bietetn den Maus-Modell. Der Zebrafisch (Danio rerio) Modell der Infektion wurde ebenfalls untersucht, um sichtbar zu machen, durch nicht-invasive Bildgebung, das Fortschreiten und die Chronologie der M. abscessus Infektion in einem lebenden Tier 19. Wichtig ist, dass ein Proof of Concept auch gegründet, um seine Tauglichkeit für die in vivo-Antibiotikum, Einschätzungen gegen M. demonstrieren abscessus 17,20.

Der Zebrafisch wurden weit verbreitet in den letzten zwei Jahrzehnten verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts 21 zu studieren. Der zunehmende Erfolg dieses alternativen Wirbeltiermodell stützt sich auf große und einzigartige Möglichkeiten, die motiviert und validiert seine Verwendung für ein besseres Verständnis der zahlreichen viralen und bakteriellen Infektionen 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Wie die meisten anderen Tiermodellen gegenüberliegen, sind Zebrafischembryonen optisch transparent, so dass nicht-invasive Fluoreszenzbildgebung 30 ha. Dieses führte zu M. studieren abscessus infiziert Zebrafischembryonen mit beispiellosen Details, die ihren Höhepunkt mit der Beschreibung der extrazellulären Aufzeichnung, die ein Beispiel der bakteriellen morphologische Plastizität zu vertreten. Cording stellt einen neuen Mechanismus der Subversion des Immunsystems und einen Schlüsselmechanismus zur Förderung Pathogenese der akuten M. abscessus Infektion 19.

Dieser Bericht beschreibt neue Werkzeuge und Methoden unter Verwendung des Zebrafischembryo, um die pathophysiologischen Merkmale des M. entziffern abscessus Infektion und die intime Wechselwirkungen zwischen der Bazillen und das angeborene Immunsystem zu untersuchen. Zuerst wird ein detailliertes Protokoll, das die Mikroinjektion Verarbeitung des bakteriellen Inokulums Embryo Herstellung und Infektion per se beinhaltet, wird vorgestellt. Methoden spezifisch angepasst, um M. bewerten abscessus Virulenz durch Messung verschiedener Parameter, wie beispielsweise Wirts Überleben und bakterielle Belastung, werden vorgestellt. Ein besonderer Fokus liegt auf, wie angegebenzur Überwachung, in einem räumlich-zeitlichen Ebene das Schicksal und die Progression der Infektion und dem Wirtsimmunantwort auf M. abscessus mittels Videomikroskopie. Darüber hinaus, um den Beitrag und die Rolle von Makrophagen bei M. untersuchen abscessus Infektion, Methoden, um Makrophagen verarmten Embryonen (entweder genetically- oder chemisch basierte Ansätze) beschrieben zu erzeugen. Schließlich Protokolle, um die spezifischen Wechselwirkungen mit Makrophagen oder Neutrophile mit festen oder lebenden Embryonen dokumentiert sind zu visualisieren.

Das Ziel dieses Berichts ist es, weitere Untersuchungen anzuregen, neue Licht in M. vergossen abscessus Virulenzmechanismen und insbesondere die Rolle der Aufzeichnung in der Einrichtung einer akuten und unkontrollierte Infektionsprozess.

Protocol

Zebrafisch experimentellen Verfahren müssen die relevanten institutionellen und staatlichen Vorschriften. Für die vorliegende Studie wurden Zebrafisch-Experimenten an der Universität Montpellier getan, nach EU-Richtlinien für den Umgang mit Labortieren (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) und unter dem Referenz zugelassen CEEA-LR-13007. 1. Vorbereitung der Reagenzien und Mikroinjektion Ausrüstung Bereiten Fischwasser durch Lösen von 0,06 g Inst…

Representative Results

Obwohl verschiedene anatomische Stellen injiziert 32 werden, sind Schwanzvene Injektionen oft verwendet, um eine systemische Infektion für spätere Analysen einschließlich Überlebensexperimente, bakterielle Belastung Bestimmung Phagozytoseaktivität oder Schnur Bildung zu erzeugen. Injektionen in die Schwanzmuskeln werden verwendet, um die Rekrutierung von Makrophagen an der Stelle der Injektion (3A) zu beurteilen. Zu untersuchen und zu vergleichen, die Virulenz von R- und S-Varianten von …

Discussion

Der Zebrafisch hat vor kurzem als eine ausgezeichnete Wirbeltiermodellsystem zur Untersuchung der Dynamik von bakteriellen Infektionen mit breiten Feld und konfokale Bildgebung in Echtzeit 36. Die Kombination aus verteilt mykobakteriellen Suspensionen (Protokoll 2.2) zusammen mit Mikro-Injektionsverfahren (Protokoll 4) ermöglicht reproduzierbare systemische Infektionen und eine spätere Überwachung und Visualisierung des Verlaufs der Infektion mit einem besonderen Fokus auf den bakteriellen Interaktionen mi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken K. Kissa für hilfreiche Diskussionen und für die Bereitstellung von Lipo-Clodronat und L. Ramakrishnan für die großzügige Gabe der pTEC27 und pTEC15, die die Expression tdTomato und Wasabi zu ermöglichen sind. Diese Arbeiten sind Teil der Projekte des Französisch National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 und DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) und Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7-PEOPLE-2011-ITN) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. PITN-GA-2011-289209 für die Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Wir möchten auch die Vereinigung von Gregory Lemarchal und Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) für die Finanzierung CM Dupont danken.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
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References

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
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