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Immunologie et infection

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em> Mycobacterium abscessus</em> In Zebrafish embrioni

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus è un patogeno emergente che provoca un ampio spettro di sindromi cliniche nell'uomo. Questi includono le infezioni cutanee e polmonari croniche gravi infezioni, soprattutto incontrate in immunocompromessi e nei pazienti affetti da fibrosi cistica 1,2,3,4. M. abscessus è anche considerato come una delle principali specie di micobatteri rapida crescita responsabili di infezioni nosocomiali e iatrogene negli esseri umani. Inoltre, diversi rapporti recenti hanno evidenziato la possibilità che M. abscessus potrebbe attraversare la barriera emato-encefalica e indurre lesioni importanti del sistema nervoso centrale (CNS) 5,6. Pur essendo un produttore rapida, M. mostre abscessus inoltre diverse funzionalità patogeni che sono legati a quelli di Mycobacterium tuberculosis, tra cui la capacità di rimanere in silenzio per anni all'interno delle strutture granulomatose e di generare lesioni caseosi nei polmoni 7. Più allarmante è il basso sensibilità di M. abscessus agli antibiotici, rendendo queste infezioni estremamente difficili da trattare portando ad un significativo tasso di fallimento terapeutico 8,9. La minaccia importante di questa specie è soprattutto la sua resistenza intrinseca agli antibiotici, che è di grande preoccupazione nelle istituzioni sanitarie pubbliche di 10 e una controindicazione al trapianto polmonare 11.

M. abscessus display lisce (S) o ruvidi morfotipi (R), colonia che portano a differenti esiti clinici. In contrasto con il ceppo S, R batteri hanno una tendenza a crescere un'estremità all'altra, portando ad una fune o cavo struttura simile 12,13. Diversi studi indipendenti sulla base di modelli o cellulari o animali hanno rivelato il fenotipo iper-virulenza del R morfotipo 14,15. Da studi epidemiologici, i casi più gravi di M. infezioni polmonari abscessus sembrano essere associati con R varianti 16 che sono l'unica variante cheè stato visto a persistere per anni in un host infetto 3. La differenza morfotipo si basa sulla presenza (in S) o perdita (in R) di glycopeptidolipids-superficie associato (GPL) 12. Tuttavia, a causa delle limitazioni intrinseche dei modelli cellulari / animali usati attualmente disponibili per studiare M. infezione abscessus, le nostre conoscenze sugli eventi fisiopatologici delle varianti R o S rimane oscuro. L'infezione di topi immuno-competenti via endovenosa o aerosol porta alla colonizzazione transitoria, impedendo l'uso di topi per studiare le infezioni persistenti e de vivo droga suscettibilità test 17. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali suscettibili alla manipolazione della risposta dell'ospite è una sfida importante. In questo contesto, i modelli non mammiferi di infezione sono stati sviluppati recentemente, compresi Drosophila melanogaster 18 che offre diversi vantaggi come il costo, velocità e etico accettabilità over il modello di topo. Il pesce zebra (Danio rerio) modello di infezione è stata anche esplorata da visualizzare, per l'imaging non invasivo, la progressione e la cronologia di M. infezione abscessus in un animale vivo 19. È importante sottolineare che una prova di concetto è stato anche istituito per dimostrare la sua idoneità per le valutazioni di antibiotici in vivo contro M. abscessus 17,20.

Il pesce zebra sono stati ampiamente utilizzati nel corso degli ultimi due decenni a studiare le interazioni tra vari agenti patogeni e il sistema immunitario dell'ospite 21. Il crescente successo di questo modello vertebrato alternativa si basa su grandi e uniche opportunità che motivati ​​e convalidati suo utilizzo per una migliore comprensione di numerose infezioni virali e batteriche 19,22,23,24,25,26,27,28,29. A differenza di molti altri modelli animali, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo non invasivo imaging di fluorescenza 30. Questo hās portato a studiare M. abscessus infettato embrioni di zebrafish con dettagli senza precedenti, che si conclude con la descrizione di cording extracellulare, che rappresentano un esempio di batterica plasticità morfologica. Cording rappresenta un nuovo meccanismo di eversione del sistema immunitario e un meccanismo chiave promuovere patogenesi acuta M. infezione abscessus 19.

Questo rapporto descrive nuovi strumenti e metodi che utilizzano l'embrione zebrafish di decifrare i tratti fisiopatologiche di M. abscessus infezione e per studiare le interazioni intime tra i bacilli e il sistema immunitario innato. Innanzitutto, un protocollo microiniezione dettagliata che comprende l'elaborazione dell'inoculo batterico, preparazione embrione, e l'infezione di per sé, è presentato. Metodi specificamente adattato per valutare M. virulenza abscessus misurando diversi parametri, come la sopravvivenza di accoglienza e la carica batterica, sono presentati. Particolare attenzione è data da comemonitorare, a livello spazio-temporale, il destino e la progressione dell'infezione e la risposta immunitaria a M. abscessus usando la microscopia video. Inoltre, per indagare il contributo e il ruolo dei macrofagi durante M. abscessus infezione, i metodi per generare macrofagi-impoverito embrioni (utilizzando approcci sia genetically- o basati su chimicamente) sono descritte. Infine, i protocolli di visualizzare le specifiche interazioni con macrofagi o neutrofili utilizzando sia gli embrioni fissi o viventi sono documentati.

Lo scopo di questo rapporto è quello di stimolare ulteriori studi per gettare nuova luce in M. meccanismi di virulenza abscessus e in particolare il ruolo del cording nella creazione di un processo di infezione acuta e incontrollata.

Protocol

Le procedure sperimentali zebrafish devono rispettare le relative norme istituzionali e governativi. Per il presente studio, esperimenti zebrafish sono stati fatti presso l'Università di Montpellier, secondo le linee guida dell'Unione europea per la movimentazione di animali da laboratorio (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) e approvati con il riferimento CEEA-LR-13007. 1. Preparazione dei reagenti e Microiniezione attrezzature Preparare pe…

Representative Results

Anche se vari siti anatomici possono essere iniettati 32, iniezioni vena caudale sono spesso utilizzati per generare infezioni sistemiche per le successive analisi, tra cui esperimenti di sopravvivenza, la determinazione della carica batterica, attività fagocitosi o formazione cavo. Iniezioni nei muscoli posteriori sono utilizzati per valutare il reclutamento di macrofagi al sito di iniezione (Figura 3A). Per studiare e confrontare la virulenza di varianti R e S di M. abscessus,…

Discussion

Il pesce zebra è recentemente emerso come un ottimo sistema modello vertebrato per lo studio delle dinamiche di infezione batterica con ampio campo e l'imaging confocale in tempo reale 36. La combinazione di sospensioni disperse micobatterici (protocollo 2.2) insieme con i metodi di micro-iniezione (protocollo 4) permette di infezioni sistemiche, riproducibili e successivo monitoraggio e visualizzazione della progressione dell'infezione con un focus particolare sulle interazioni batteriche con macrof…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati a K. Kissa per le discussioni utili e per fornire lipo-clodronato e L. Ramakrishnan per il dono generoso di pTEC27 e pTEC15 che permettono espressione di tdTomato e Wasabi, rispettivamente. Questa opera fa parte dei progetti dell'Agenzia nazionale di ricerca francese (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 e DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) e il Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7-PEOPLE-2011-ITN) sotto contratto di concessione n. PITN-GA-2011-289209 per il Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. Desideriamo inoltre ringraziare l'Associazione Gregory Lemarchal e Sconfiggere la mucoviscidosi (RF20130500835) per il finanziamento di CM Dupont.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
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References

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
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